第十三章-分光光度法

第十三章分光光度法第一節(jié)概述分光光度法是利用被測物質在特定波長處或一定波長范圍內對光的選擇性吸收特性而建立的一種分析方法，屬于光譜分析法。分類：根據測定的光的波長分紫外分光光度法可見分光光度法紅外分光光度法特點：靈敏度高，適用于微量或痕量組分的分析操作簡單、準確度較高、重現性好、應用范圍廣一、光的性質與波長范圍光是一種電磁波，具有波粒二象性，即波動性和粒子性。光在傳播時表現了光的波動性一定的光波具有一定的波長、頻率、光速c等參數來描述：

c=

光的性質續(xù)前：波長：相鄰兩波峰或波谷之間的距離，波長的單位可用納米（nm），微米（um）表示：1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m頻率（

）：是每秒內光波的振動次數，單位是赫茲（Hz）續(xù)前光又具有粒子性，是由一顆一顆不連續(xù)的光子構成的粒子流，這種粒子叫光子，是量子化的。光子的能量（E）取決于頻率，其關系為：

E=h=hc/

（h為普朗克常數：h=6.626×10-34J·S)可見：光的波長越短（頻率越高），其能量越大。光的分類單色光：僅含某一種波長的光復合光：不同波長的光組合而成。如白光。物質對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補光。波長范圍：可見光區(qū)：400-760nm復合光紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm

遠紫外區(qū)100-200nm

紅外光區(qū)：0.76~500um

近紅外區(qū)：0.76~2.5um

中紅外區(qū)：2.5~50um

遠紅外區(qū)：50~500um二、分子吸收光譜的產生分子運動包括：分子外層的價電子運動——電子能級分子內原子在平衡位置附近的振動——振動能級分子繞重心軸的轉動——轉動能級分子能量：電子能量、振動能量、轉動能量之和

E電>E振>E轉

高能級的運動中包括低能級的運動續(xù)前當用一定波長的光線照射試樣時，其分子選擇吸收了某些具有特定波長（或頻率）的光子后，由較低能級（基態(tài)）躍遷到較高能級（激發(fā)態(tài)）時，所吸收光子的能量正好等于躍遷前后的能級差。把分子吸收能量隨波長變化的情況記錄下來所得的圖譜為吸收光譜。利用物質的吸收光譜進行定性、定量及結構分析的方法稱為吸收光譜法，簡稱光譜法。三、光的吸收定律（一）百分透光率（T）和吸收度（A）入射光I0→吸收Ia→透射ItI0=Ia+It

透光率（描述入射光透過溶液的程度）

T=It/I0或T%=It/I0×100%

透光率的負對數稱為吸光度，用符號A表示。吸光度A=-lgT=lg

I0/ItA愈大，溶液對光的吸收愈多。（二）朗伯-比爾定律當一束平行的單色光通過均勻、無散射現象的溶液時，在單色光強度、溶液的溫度等條件不變的情況下，溶液對光的吸收度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。A=－lgT=ECL

朗伯-比爾定律適用于無色溶液、有色溶液及氣體和固體的非散射均勻體系。（三）吸收系數吸光物質在單位濃度、單位液層厚度時的吸收度。當溶液的濃度C的單位不同時，吸收系數的意義和表示方法也不同，常用的表示方法有兩種：1、摩爾吸收系數：是指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時的吸收度，用ε表示。2、百分吸收系數：是指在一定波長下，溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時的吸收度，表示。續(xù)前百分吸收系數與摩爾吸收系數之間的關系是：吸收系數是物質的特性常數，表明物質對某一特定波長光的吸收能力。不同物質對同一波長的單色光有不同的吸收系數，吸收系數越大，表明吸光能力越強，靈敏度越高，所以吸收系數是物質定性和定量分析的依據。四、吸收光譜吸收光譜又稱吸收曲線，是在濃度一定的條件下，以波長（λ）或波數（δ）為橫坐標，以吸收度（A）為縱坐標所描繪的曲線。吸收峰最大吸收波長λmax

吸收谷最小吸收波長λmin

肩峰λsh

末端吸收續(xù)前λmax、λmin、λsh及整個吸收光譜的形狀取決于物質的分子結構，可作為定性分析的依據。同一物質的吸收光譜應有相同的λmax、λmin、λsh；而且在相同濃度時，同一物質的吸收曲線應相互重合。第二節(jié)紫外-可見分光光度法一、基本原理物質分子受到紫外-可見光的照射，選擇吸收某些適宜能量的光子后，其原子的外層電子（成鍵電子、未成鍵電子）由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，在相應波長的位置出現吸收所形成的光譜，稱為紫外-可見吸收光譜。適用范圍：分子中含有芳環(huán)或共軛雙鍵的有機藥物，在紫外光區(qū)有特征吸收外觀有顏色的藥物在可見光區(qū)有特征吸收都可用紫外-可見分光光度法進行分析。儀器可見分光光度計721型分光光度計儀器紫外-可見分光光度計一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示器1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在350～1000nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射200～360nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計、數字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理二、分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產生交流信號。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數光譜。三種分光光度計的比較721型分光光度計的使用第三節(jié)藥物分析中含量測定和微量雜質的檢查紫外可見分光光度法是藥物分析中的一種重要的方法，常用語藥物鑒別、檢查和含量測定（一）定性鑒別根據物質的吸收光譜特征，如吸收光譜的形狀、最大吸收波長、吸收峰數目、各吸收峰的位置，強度和相應的吸收系數等進行分析。1、比較光譜的一致性兩個化合物相同，在相同的條件下測出的吸收光譜應完全相同。具體做法：（1）樣品與標準品在完全相同的情況下，分別測出吸收光譜，比較二者光譜是否一致（2）沒有標準品，用標準光譜圖對歸照比較，二者吸收光譜一致，可初步斷定是同一化合物。注意：結構完全相同的物質，其吸收光譜完全一致，但吸收光譜完全相同的物質卻不一定是同一物質。

2、比較吸收光譜特征數據的一致性常用最大吸收波長和吸收系數不同的化合物，可有相同的最大吸收波長，但因分子量不同，其百分吸收系數有明顯的差異。3、比較吸收度或吸收系數比值的一致性適用于吸收峰較多的藥物，各吸收峰對應的吸收度或吸收系數的比值是一定的，可作為鑒別的標準。用分光光度法進行鑒別時的要求:

儀器必須按要求嚴格校正合格后方可使用樣品的純度必須達到要求才能測定一、含量測定1、吸收系數法：（1）利用待測物質的吸收系數與測得的一定濃度時的吸收度比較計算含量的方法，又稱絕對法。根據朗伯-比爾定律A=ECL，得：例1已知維生素B12在361nm處的E值是207，現測得維生素B12水溶液的吸收度為0.414，吸收池厚度為1cm，求該溶液的濃度。解：即該溶液的濃度為0.002%（g/ml），即100ml維生素B12水溶液中含維生素B120.002g。1、吸收系數法：（2）按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的標準溶液吸收系數計算含量。例2精密稱取維生素B12供試品25.0mg，加水溶解并稀釋制成1000ml，于1cm厚的吸收池中，在361nm處測得吸收度為0.507，按C68H88CoN14O14P的為207計算，求維生素B12的含量百分比。

解：2、標準曲線法是分光光度法中最經典的方法。特點：對儀器要求不高，是分光光度法中簡便易行的方法。步驟：（1）標準系列：先用于待測物質組分相同的標準品，配成一系列濃度不同的標準溶液，在相同條件下，分別測定其吸收度。（2）繪制標準曲線：以濃度C為橫坐標，以相應的吸收度A為縱坐標，繪制A-C曲線，稱為工作曲線。（3）查找：在相同條件下，測出供試品溶液的吸收度，從標準曲線上便可查出與此吸收度值相應的供試品溶液的濃度。注意事項：1、標準系列的數目應在四個伊桑2、注明時間、測定項目和條件3、條件發(fā)生改變時，應重新繪制標準曲線3、對照品比較法在相同條件下，配制標準對照品和供試品溶液，在選定的波長處分別測定吸收度A標和A供。根據：A標=EC標LA供=EC供L

標準對照品與供試品是同一種物質，在同一儀器、同一波長下測定，因此L和E相等。例3精密稱取奧沙西泮供試品與對照品各15mg，加乙醇溶解并稀釋至200ml，再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，在229nm波長處測定吸收度分別為：A供=0.462，A標=0.470，求奧沙西泮的含量。解：供試品與標準品在相同條件下配制與測定，C標=C原續(xù)前優(yōu)點：對照法采用對照品與供試品平行操作的方式，具有消除儀器與方法誤差的優(yōu)點，是中國藥典中采用較多的方法。二、微量雜質的檢查方法雜質：任何影響藥品純度的物質均稱雜質，可在生產中或運輸中產生雜質檢查也叫純度檢查藥物中微量雜質的檢查方法較多用比色法和分光光度法

（一）、比色法常用來檢查無機雜質離子。應用：利用雜質離子與其他物質生成有色物質或生成難溶物使得溶液渾濁，再與標準品比較。目視比色法是用眼睛辨別、比較供試品溶液與標準溶液的顏色深