第十章免疫分析技術(shù)

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教研室宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院第十章

免疫分析技術(shù)和相關(guān)儀器學(xué)習(xí)要求

掌握臨床免疫檢驗(yàn)常用儀器的特點(diǎn);熟悉臨床免疫檢驗(yàn)常用儀器的分析原理;

了解臨床免疫檢驗(yàn)常用儀器的使用與維護(hù)。主要內(nèi)容

酶免疫分析儀

發(fā)光免疫分析儀放射免疫分儀析儀免疫濁度分析儀時(shí)間分辨熒光免疫分析儀第一節(jié)酶免疫分析儀第一節(jié)一、酶免疫技術(shù)的分類

二、酶免疫分析儀的類型、工作原理及結(jié)構(gòu)

三、酶免疫分析儀的性能評(píng)價(jià)及維護(hù)保養(yǎng)四、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物，可分為:

酶擴(kuò)大免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定克隆酶供體免疫測(cè)定液相酶免疫法均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫法(ELISA）

一、酶免疫技術(shù)的分類基本概念二、酶免疫分析儀的類型、工作原理及基本結(jié)構(gòu)酶標(biāo)儀一般簡(jiǎn)單的酶標(biāo)儀只有讀數(shù)、數(shù)據(jù)處理的功能，還需要配置孵育箱，洗板機(jī)，人工操作步驟繁瑣。

全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)集加樣品、加試劑、孵育、震蕩、洗板和酶標(biāo)儀功能于一體。

（一）酶免疫分析儀的類型-1微孔板固相酶免疫測(cè)定儀器(酶標(biāo)儀)半自動(dòng)微孔板ELISA分析儀全自動(dòng)微孔板ELISA分析儀管式固相酶免疫測(cè)定儀器小珠固相酶免疫測(cè)定儀器磁微粒固相酶免疫測(cè)定儀器等

（一）酶免疫分析儀的類型-21.微孔板固相酶免疫測(cè)定儀器(酶標(biāo)儀)

有單通道和多通道兩種類型工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計(jì)相同和不同之處在于：比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通過(guò)待測(cè)液

酶標(biāo)儀的工作原理圖2.自動(dòng)化酶免疫分析系統(tǒng)在酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上再加上配置:

加樣系統(tǒng)溫育系統(tǒng)洗板系統(tǒng)判讀系統(tǒng)機(jī)械臂系統(tǒng)液路動(dòng)力系統(tǒng)軟件控制系統(tǒng)

系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)-1自動(dòng)化程度高：前后處理一體化設(shè)計(jì)，減少人與樣品的接觸機(jī)會(huì)，降低污染。能進(jìn)行各種自動(dòng)安全檢測(cè)。穩(wěn)定：只要避免人為操作錯(cuò)誤，可連續(xù)數(shù)年良好工作。準(zhǔn)確：不存在交叉污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)-2高速：加注、讀板速度快擴(kuò)展性：軟件可升級(jí)，樣本量增加，可聯(lián)機(jī)使用用戶做主更多：開放式試劑；WINDOW操作系統(tǒng)；中/英/日自選操作界面；自定義編程；自動(dòng)/自定義時(shí)間表；無(wú)限存檔。三、酶免疫分析儀的性能評(píng)價(jià)及維護(hù)保養(yǎng)（一）性能評(píng)價(jià)1．濾光片波長(zhǎng)精度檢查及其峰值測(cè)定；2．靈敏度和準(zhǔn)確度；3．通道差與孔間差檢測(cè)；4．零點(diǎn)漂移；5．精密度評(píng)價(jià)；6．線性測(cè)定；7．雙波長(zhǎng)評(píng)價(jià)；三、酶免疫分析儀的性能評(píng)價(jià)及維護(hù)保養(yǎng)（二）維護(hù)保養(yǎng)重點(diǎn)：光學(xué)部分

1．濾光片波長(zhǎng)精度檢查

2．通道差與孔間差檢測(cè)四、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用１.病原體及其抗體的檢測(cè)

2.各種免疫球蛋白和細(xì)胞因子、補(bǔ)體

3.腫瘤標(biāo)志物

4.多種激素

5.藥物和毒品等。第二節(jié)發(fā)光免疫分析儀

將發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析方法采用微量倍增技術(shù)，敏感性度，特異性好，所用試劑安全、穩(wěn)定；檢測(cè)范圍廣泛，從傳統(tǒng)的蛋白、激素、酶乃至藥物均可檢測(cè)發(fā)展迅速，各種儀器不斷出現(xiàn)，自動(dòng)化程度越來(lái)越高。一、發(fā)光免疫的分類-1酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光：吖啶酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)三價(jià)鐵-魯米諾系統(tǒng)閃光（Flash）發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(InSituInjector)和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）

發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如：

-HRP-Luminol系統(tǒng)

-AP-AMPPD系統(tǒng)

-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。按發(fā)光持續(xù)時(shí)間一.發(fā)光免疫的分類-2時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光-輝光測(cè)量方式差別消除放射性危害無(wú)半衰期限制，試劑穩(wěn)定性、有效期延長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測(cè)定優(yōu)越性-1閃光-輝光測(cè)量方式差別適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)多指標(biāo)測(cè)定操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化靈敏度和線性范圍超過(guò)以往技術(shù)優(yōu)越性-2閃光-輝光測(cè)量方式差別三.發(fā)光免疫技術(shù)分類根據(jù)示蹤物檢測(cè)的不同而分為：熒光免疫測(cè)定電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光免疫---再根據(jù)標(biāo)記物的不同又分：

-化學(xué)發(fā)光免疫分析

-微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析

-電化學(xué)發(fā)光免疫分析

-化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

-生物發(fā)光免疫分析臨床以前三者較為常用。三.發(fā)光免疫分析的基本測(cè)定方法根據(jù)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)方式的不同可分為

1．液相法反應(yīng)在液相中進(jìn)行，經(jīng)離心或分離措施后，再進(jìn)行測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度

2．固相法將抗原抗體復(fù)合物結(jié)合在固相載體(如聚苯乙烯管)或分離介質(zhì)上(如磁性微粒球等)，再進(jìn)行測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度

3．均相法同均相酶免疫法，不需要經(jīng)過(guò)離心或分離步驟，即可直接進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)夾心法特點(diǎn)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：

測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：

功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度。相關(guān)系數(shù)：≥0.99的曲線范圍。四、發(fā)光免疫分析儀的種類、工作原理和基本結(jié)構(gòu)(一)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的免疫分析系統(tǒng)(一)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1．儀器測(cè)定原理

該類分析技術(shù)有兩種方法：-競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定小分子抗原物質(zhì)-夾心法測(cè)定大分子抗原物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)法特點(diǎn)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：

（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：

功能靈敏度-變異≤20%的最高檢測(cè)濃度。相關(guān)系數(shù)：≥0.99的曲線范圍。(一)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)一般由主機(jī)和微機(jī)兩部分組成：（1）主機(jī)部分：包括原材料配備部分：反應(yīng)杯、樣品盤、試劑盤、純凈水、清洗液、廢水在機(jī)器上的貯存和處理裝置。液路部分：過(guò)濾器、密封圈、真空泵、管道、樣品及試劑探針。機(jī)械傳動(dòng)部分：傳感器、運(yùn)輸軌道。光路檢測(cè)部分：光電倍增管和線路控制板。2．儀器組成全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)66IMMUNOLOGY(一)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)2．儀器組成（2）微機(jī)系統(tǒng)程控操作指示判定數(shù)據(jù)處理故障診斷自動(dòng)監(jiān)視（二)全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

采用微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)人體內(nèi)的微量物質(zhì)以及藥物濃度進(jìn)行定量測(cè)定具有高度的特異性、高度的敏感性和高度的穩(wěn)定性等特點(diǎn)全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1.分析方法采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為發(fā)光劑，擴(kuò)大測(cè)定的范圍。以免疫測(cè)定方法為基礎(chǔ)：

-競(jìng)爭(zhēng)法

-夾心法

-抗體檢測(cè)等

2.分析過(guò)程抗原抗體結(jié)合；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體；形成固相包被復(fù)合物；在電磁場(chǎng)中進(jìn)行2~3次洗滌分離；加入底物；通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度；在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的濃度。3.儀器組成微電腦控制樣品處理系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行系統(tǒng)中心供給和控制系統(tǒng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在新一代實(shí)驗(yàn)室免疫檢測(cè)技術(shù)中很有特點(diǎn)，它在20世紀(jì)如年代一問(wèn)世就引起廣泛的關(guān)注德國(guó)公司在鏈酶親和素—生物素包被技術(shù)基礎(chǔ)上，引用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)并開發(fā)出相應(yīng)的全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)1.測(cè)定原理及過(guò)程待測(cè)標(biāo)本與包被了抗體的順磁性微粒和發(fā)光劑標(biāo)記的抗體共同溫育（形成磁性微珠包被抗體—抗原—發(fā)光劑標(biāo)記抗體復(fù)合物）吸人流動(dòng)室，緩沖液沖洗磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被電極下的磁鐵吸引，而游離的發(fā)光劑標(biāo)記抗體被沖洗走

同時(shí)在電極加電壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使發(fā)光試劑標(biāo)記物三氯聯(lián)吡啶釘[Ru(bpy)3]2+TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比2.儀器組成及特點(diǎn)由樣品盤、試劑盒、溫育反應(yīng)盤、電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)組成應(yīng)用三種抗原抗體反應(yīng)方法：

-抑制免疫法檢測(cè)小分子量蛋白抗原

-夾心免疫法檢測(cè)大分子量物質(zhì)

-橋聯(lián)免疫法檢測(cè)抗體如IgG、IgM

另：釘標(biāo)記用于DNA／RNA探針分析主要應(yīng)用于以下幾方面檢測(cè)：1．甲狀腺系統(tǒng)2．性腺系統(tǒng)3．血液系統(tǒng)4．腫瘤標(biāo)記物5．心血管系統(tǒng)6．血藥濃度7．感染性疾病8．其他檢測(cè)（Ig、血清皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、尿游離脫氧吡啶等）第三節(jié)放射免疫分析儀

放射性核素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合放射免疫技術(shù)主要包括：

-放射免疫分析(,RIA)-免疫放射分析或免疫放射度量分析(IRMA)一、放射性核素的種類特點(diǎn)和檢測(cè)儀的基本結(jié)構(gòu)（一）放射性核素的種類和特點(diǎn)

放射性核素依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍及γ計(jì)數(shù)器測(cè)定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、57Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用一、放射性核素的種類特點(diǎn)和檢測(cè)儀的基本結(jié)構(gòu)（二）檢測(cè)的基本結(jié)構(gòu)及其探測(cè)原理將射線（放射能）與閃爍體的作用轉(zhuǎn)換成光脈沖（光能），然后用光電倍增管將光脈沖轉(zhuǎn)換成電脈沖（電能）。電脈沖在單位時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)（即儀器記錄的cmp值）反映了發(fā)出射線的頻率電脈沖的電壓幅度則反映了射線能量的高低。二、晶體閃爍計(jì)數(shù)器組成和工作原理（一）儀器組成及工作原理

1．閃爍體

2．光電倍增管

（1）光陰極（2）打拿極（3）陽(yáng)極

3．多道脈沖分析器

多道分析器（MCA）是進(jìn)行能譜分析的重要儀器。現(xiàn)代的MCA與通用微型計(jì)算機(jī)有許多共同特性，是現(xiàn)代核探測(cè)分析及放射影像裝置的重要組成部分。（二）γ-輻射計(jì)數(shù)器整機(jī)可分為：采樣部分---探頭、換樣裝置、高低壓電源、放大器及單道組成數(shù)據(jù)處理部分---接口、計(jì)算機(jī)、輸入輸出裝置三.放射免疫分析儀的應(yīng)用常用于測(cè)定：激素微量蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物藥物第四節(jié)免疫比濁分析儀

現(xiàn)在臨床上測(cè)定微量蛋白(如Ig等)已發(fā)展到現(xiàn)代自動(dòng)免疫分析技術(shù)，其靈敏度逐步提高，檢測(cè)水平由微克到納克，甚至皮克水平。

微量蛋白免疫分析隨著自動(dòng)化程度不斷提高，在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其自動(dòng)化檢測(cè)方法主要為免疫比濁法免疫比濁法免疫透射濁度測(cè)定法免疫透射比濁法免疫膠乳濁度測(cè)定法

終點(diǎn)散射比濁法免疫散射比濁法

速率散射比濁法

光路示意圖如下：免疫分析比濁技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)(1)穩(wěn)定性好，敏感性高(2)分析簡(jiǎn)便、快速(3)避免標(biāo)本之間及標(biāo)本對(duì)人的污染(4)標(biāo)本用量少（一）免疫透射比濁測(cè)定免疫透射比濁度測(cè)定(turbidimetry)

免疫透射比濁測(cè)定免疫膠乳濁度測(cè)定光路示意見下圖：1.免疫透射比濁測(cè)定原理

抗原抗體在緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過(guò)剩時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加。2.免疫膠乳濁度測(cè)定法原理選擇均勻一致的膠乳顆粒吸附抗體，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，發(fā)生凝集；單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò)。當(dāng)兩個(gè)膠乳顆粒凝集時(shí)，則使透過(guò)光減少，減少的程度與膠乳凝聚成正比。（二）激光散射濁度測(cè)定激光散射濁度測(cè)定(nephelometry)分為：

-終點(diǎn)散射比濁法(endnephelometry)-速率散射比濁法(ratenephelometry)基本原理：激光散射光系沿水平軸照射，碰到抗原—抗體復(fù)合物時(shí)，導(dǎo)致光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)0o

～90o，其偏轉(zhuǎn)角度因光線波長(zhǎng)、離子大小不同而有所區(qū)別。散射光的強(qiáng)度與抗原-抗體復(fù)合物的含量成正比，和散射夾角成正比，和波長(zhǎng)成反比。1.終點(diǎn)散射比濁法

抗原—抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)（通常為30～60分鐘），復(fù)合物濁度不再受時(shí)間的影響，在聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)行濁度測(cè)定。散射比濁法是測(cè)定抗原與抗體結(jié)合完成后測(cè)定其復(fù)合物的量。2.速率散射比濁法

速率是指抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中，在單位時(shí)間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率散射比濁法是在抗原與抗體反應(yīng)的最高峰(約在1分鐘內(nèi))測(cè)定其復(fù)合物形成的量，該法具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

3.激光散射濁度測(cè)定儀(1)ARRAY特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)由微電腦控制，可以定量檢測(cè)體液中微量蛋白的全自動(dòng)組合儀器。儀器主要部件（1）散射測(cè)濁儀光源采用雙光源碘化硅晶燈泡(400-620nm)；（2）加液系統(tǒng)具有液體感知裝置，控制加液體積的準(zhǔn)確性；（3）試劑和樣品盤（4）閱讀器讀取卡片內(nèi)貯存的參數(shù)。

儀器主要特點(diǎn)：

IC懸浮顆粒所產(chǎn)生的散射光速率變化強(qiáng)弱與抗原濃度成正比；速率峰值經(jīng)微電腦處理轉(zhuǎn)換成抗原濃度；測(cè)到所需的速率峰值后，儀器通過(guò)峰值鑒定程序再對(duì)此峰值進(jìn)行確證；抗原過(guò)剩的監(jiān)測(cè)在抗原過(guò)剩的情況下，儀器重新對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，然后再次測(cè)定；使用抗體、標(biāo)準(zhǔn)血清、抗體卡片和校正卡片。DB100特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)，由分析儀、計(jì)算機(jī)打印機(jī)、條碼讀取器四部分組成。分析儀是該系統(tǒng)的主要部分，包括：（1）散射測(cè)濁儀光源采用發(fā)光二極管（2）加液系統(tǒng)（3）支架運(yùn)輸裝置（4）比色杯裝置儀器主要特點(diǎn)：固定時(shí)間測(cè)定：利用兩個(gè)時(shí)間光散射檢測(cè)之間的差異，在免疫反應(yīng)混合物預(yù)備10秒鐘測(cè)定第一次光散射的值t1)，然后在反應(yīng)6分鐘后測(cè)定第二次光散射的值(t2)

終點(diǎn)檢測(cè)法：檢測(cè)預(yù)溫30分鐘后光散射的值(t1)。通