第2章 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

第二章細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)§1細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)掃描隧道顯微鏡光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。（一）普通光學(xué)顯微鏡1.物鏡轉(zhuǎn)換器2.接物鏡3.游標(biāo)卡尺4.載物臺(tái)5.聚光器6.彩虹光闌7.光源8.鏡座9.電源開關(guān)10.光源滑動(dòng)變阻器11.粗調(diào)螺12.微調(diào)螺旋13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.標(biāo)本移動(dòng)螺旋3.分辨率：指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。分辨距離越小，則分辨能力越高。R=0.61λ/N．A．λ為入射光線波長(zhǎng)；N．A．（鏡口率）

＝ｎsinα/2，n=介質(zhì)折射率；α=物鏡鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？N·A：顯微鏡物鏡的鏡口率—光學(xué)性能指標(biāo)，每個(gè)物鏡上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。幾種介質(zhì)的折射率物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質(zhì)折射率的限制，不可能有更大提高。所以科學(xué)家們從另外兩個(gè)途徑來改進(jìn)顯微鏡：換用短波長(zhǎng)的“照明光源”，來提高分辨能力。如：紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)反差，來提高分辨能力。（二）熒光顯微鏡

Fluorescencemicroscope特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨能力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。（二）熒光顯微鏡

Fluorescencemicroscope原理：以紫外光為光源，使被檢材料中的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析。熒光現(xiàn)象有兩種：（１）自發(fā)熒光：細(xì)胞內(nèi)某些天然熒光物質(zhì)被紫外光照射所激發(fā)的熒光，例如葉綠素（血紅色自發(fā)熒光）；（２）誘發(fā)熒光：在細(xì)胞中加入熒光染料（熒光素），與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在一起，經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光。例：熒光染料吖啶橙，可使RNA發(fā)出紅色熒光，而使DNA發(fā)出綠色熒光。熒光顯微鏡與普通光鏡在結(jié)構(gòu)上不同之處：（1）紫外光發(fā)生裝置：高壓汞燈+激發(fā)裝置+濾光裝置；（2）透鏡由石英玻璃制成，以便減少光通路上的紫外光損耗；（3）目鏡中要裝壓紫濾片F(xiàn)luorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡原理：

光波的三個(gè)光學(xué)特性：（1）波長(zhǎng)：對(duì)于光波波長(zhǎng)變化，肉眼覺察為顏色變化;（2）振幅：對(duì)于光波振幅變化（即振幅差），肉眼覺察為明暗變化；（3）相位：指某一時(shí)刻，光在其前進(jìn)路線上的位置。對(duì)于光相位的變化（即相位差），肉眼不能覺察。當(dāng)光線穿過無色透明且非勻質(zhì)的活細(xì)胞，其波長(zhǎng)和振幅都無明顯變化，僅光相位出現(xiàn)一定程度變化。觀察時(shí)感覺反差較小，物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨。為何普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞？把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度。在構(gòu)造上，相差顯微鏡的兩個(gè)特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。作用：使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。相差板（annularphaseplate）：物鏡后加了涂有氟化鎂的相差板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相差顯微鏡原理相差顯微鏡卻是運(yùn)用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大，再經(jīng)過光波干涉作用，使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差，從而反差增強(qiáng)，便能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)了。相差顯微鏡下的樣品不需染色，可以清晰觀察活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。相差顯微鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM不同光線的波長(zhǎng)以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子束照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等４部分構(gòu)成。分辨率0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2μm、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）。（1）照明光源不同。（2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。依靠改變磁透鏡的激磁電流強(qiáng)度來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。電流強(qiáng)度的變化引起了磁場(chǎng)強(qiáng)度的改變，而磁場(chǎng)強(qiáng)度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，放大倍數(shù)隨之出現(xiàn)變化。（3）具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。電子流的發(fā)射速度及波長(zhǎng)皆取決于電壓的高低。透射電子顯微鏡特點(diǎn)（4）高度真空的工作系統(tǒng)。高速運(yùn)動(dòng)的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞，就會(huì)改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊。要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水。因此說，透射電鏡不能用來觀察活的樣品。透射電子顯微鏡特點(diǎn)（5）樣品厚度必須<900?（即90nm，0.09μm）。

電子穿透能力有限，樣品過厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會(huì)產(chǎn)生熱量，將厚樣品燒出白斑。透射電鏡觀察的樣品須超薄切片（400-500?），不能用普通光鏡下的組織切片（2-7μm）。

透射電子顯微鏡特點(diǎn)（6）標(biāo)本染色技術(shù)不同。電鏡標(biāo)本染色是使須觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對(duì)比分明，反差強(qiáng)。染色劑大多是重金屬鹽類。染色方法有正染、負(fù)染兩類。正染：常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結(jié)構(gòu)偏暗，背景較亮。負(fù)染：使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結(jié)構(gòu)顯得明亮突出。透射電子顯微鏡特點(diǎn)（7）特殊的投影技術(shù)（真空噴鍍法）。

對(duì)電鏡標(biāo)本的表面處理技術(shù)，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標(biāo)本，使其朝向發(fā)射源的表面所沉積的金屬微粒多于背面。電鏡觀察時(shí)感覺反差極強(qiáng)，具立體感。透射電子顯微鏡特點(diǎn)主要電鏡制樣技術(shù)1）超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。超薄切片技術(shù)2）負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色。吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果。分辨率可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin主要電鏡制樣技術(shù)3）冰凍蝕刻

freeze-etching標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍，然后斷開。升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。AYeastCell主要電鏡制樣技術(shù)20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。（二）掃描電子顯微鏡工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。掃描電子顯微鏡原理人類紅細(xì)胞酵母人類精子（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。掃描隧道顯微鏡原理一、離心技術(shù)分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。高速離心機(jī):轉(zhuǎn)速為10~25kr/min。超速離心機(jī):轉(zhuǎn)速>25kr/min。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法（一）差速離心

Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序細(xì)胞核——線粒體——溶酶體、過氧化物酶體——微體、高爾基體、囊泡——核蛋白體。細(xì)胞器初步分離后，再通過密度梯度離心純化。（一）差速離心

Differentialcentrifugation（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降

velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降。2.等密度沉降

isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中，經(jīng)過離心，沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法顯色劑能與待測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合。通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺，判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對(duì)含量。孚爾根反應(yīng)：特異顯示DNAPAS反應(yīng)：多糖米倫反應(yīng)：蛋白質(zhì)四氧化鋨、蘇丹紅：不飽和脂肪酸、脂滴格莫瑞法（Gomori）：堿性磷酸酶三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)：將免疫學(xué)方法（抗原—抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用于研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：用標(biāo)記的核酸探針，通過分子雜交，確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法。標(biāo)記探針方法1、放射性同位素標(biāo)記（顯微放射自顯影）2、熒光素標(biāo)記（熒光顯微鏡觀察）3、生物素標(biāo)記五、流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴；激光束的照射下，細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果。第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程（一）群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落（克?。?。一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）原代培養(yǎng)（primaryculture）：培養(yǎng)直接來自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群。傳代培養(yǎng)（Passage）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶。傳代細(xì)胞：適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下，持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞（a)和CHO（b)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無限繁殖。克?。╟lone）：由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)原生