細(xì)胞工程2講第1節(jié)植物人工繁殖

1896192019872006第二篇

人工繁殖技術(shù)

第2講

植物人工繁殖

第1節(jié)

植物組織培養(yǎng)1896192019872006上節(jié)課預(yù)習(xí)思考題：1.為什么植物組織培養(yǎng)能實(shí)現(xiàn)植物大規(guī)模繁殖？2.與傳統(tǒng)繁殖途徑的優(yōu)點(diǎn)在哪里？本講知識(shí)點(diǎn)1.組織培養(yǎng)再生植物2.人工種子本節(jié)重要問題1.激素在細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用2.植物經(jīng)組織培養(yǎng)的再生途徑虎蕊蓬萊蝶好素聞香蝶趙孟堅(jiān)春蘭圖芝蘭生於深谷，不以無人而不芳君子修道立德，不為困窮而改節(jié)

孔子清馨

淡雅空谷

幽蘭“達(dá)摩登錄世界最貴植物”達(dá)摩蘭產(chǎn)生臺(tái)灣東部，達(dá)摩日語即不倒翁的意思，花中帶花。徐木盛先生1971采集自山野，及其稀少，一般每芽百萬元臺(tái)幣以上，是蘭花愛好者追求的極品。蘭花組織培養(yǎng)：舊時(shí)王榭堂前燕，飛入尋常百姓家。?

1.細(xì)胞全能性(totipotency)：是指分化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。?

2.細(xì)胞分化（Differentiation）：是指細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程，包括時(shí)間上和空間上的分化。重要知識(shí)回顧?

3.脫分化（Dedifferentiation）：又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程，即分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。?

脫分化后的植物細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的松散的細(xì)胞團(tuán)，稱之為愈傷組織（Callus）。?

4.再分化（Redifferentiation）：是指在離體條件下，無序生長(zhǎng)的脫分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下重新進(jìn)入有序生長(zhǎng)和分化狀態(tài)的過程。?

脫分化與再分化的關(guān)系：?

離體培養(yǎng)植物組織或細(xì)胞再生植株就是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的。?

脫分化是細(xì)胞全能性表現(xiàn)的前提，再分化是細(xì)胞全能性的最終體現(xiàn)，是再生的基礎(chǔ)。一

植物組織培養(yǎng)（Plant

tissue

culture）

定義：植物組織培養(yǎng)是將植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等外植體材料無菌條件下培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下誘發(fā)長(zhǎng)成完整植株的一種技術(shù)。

（一）植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)?

1.周期短，便于人工控制培養(yǎng)條

件。繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高。?

2.占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)

限制。?

3.繁殖珍稀、瀕危苗木和突變體

，是優(yōu)良品種培育的有效途徑。?

4.利于保持原來品種的特性。形象稱為“試管植物”（二）植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1.快速繁殖：例如一株蘭花一年可以繁殖到400萬株。2.種苗脫毒：可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉等。3.突變育種：可以直接誘變篩選出具抗病、抗鹽以及高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。4.基因工程育種：基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過組織培養(yǎng)途徑實(shí)現(xiàn)植株再生。5.遠(yuǎn)緣雜交：利用離體受精技術(shù)和組織培養(yǎng)結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，培育一些罕見的新物種。例如蘋果與梨的雜交種。（三）植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.生物條件外植體（Explant）主要指用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段。因素：不同植物品種同一品種不同取材部位、發(fā)育階段。一般：生長(zhǎng)點(diǎn)、幼嫩組織2.物理?xiàng)l件：培養(yǎng)環(huán)境、組織培養(yǎng)室無菌環(huán)境，人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要。?

3.化學(xué)條件：培養(yǎng)基?

（1）無機(jī)鹽?

培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的濃度通常在

25mmol/L左右。?

根據(jù)添加量多少分為大量元素（濃度大于

0.5mmol/L）和微量元素(濃度低于0.5mmol/L)。?

大量元素：主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。氮

、硫、磷是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和酶的主要成

分。?微量元素：主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬等。這些微量元素對(duì)于蛋白或酶的生物活性十分重要，并參與生物過程的調(diào)節(jié)。（2）有機(jī)物?

常用的有機(jī)物：糖類、氨基酸、維生素、醇類等。?

糖類：既可以作為碳源，又可以維持滲透壓。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%—3%。?

氨基酸：是很好的有機(jī)氮源。最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。?

維生素：對(duì)植物生長(zhǎng)、分化等有促進(jìn)作用。大多數(shù)植物組織

培養(yǎng)通常需加入一至數(shù)種維生素：鹽酸硫胺素（Thiamine,VB1

）、鹽酸吡哆醇（Pyridoxin,VB6）、Vc（抗壞血酸）、有時(shí)

還使用生物素、葉酸、VB12等。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力

有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。Vc有防止組織變褐的作用。?

肌醇：對(duì)糖類的相互轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。?

腺嘌呤：是合成細(xì)胞分裂素的前體物質(zhì)之一。添加腺嘌呤能促進(jìn)細(xì)胞合成分裂素，有利于細(xì)胞的分裂和分化，促進(jìn)芽的形成。（3）調(diào)節(jié)物質(zhì)?

植物激素(Phytohormone)：是植物自然狀態(tài)下產(chǎn)生的、對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有顯著作用的微量有機(jī)物。能影響生長(zhǎng)和分化。?

在個(gè)體發(fā)育中，不論是種子發(fā)芽、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、繁殖器官形成以至整個(gè)成熟過程，主要由激素控制。?

植物體內(nèi)的激素與細(xì)胞內(nèi)某種稱為激素受體的蛋白質(zhì)結(jié)合后，影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，并對(duì)特殊酶的合成起調(diào)控作用，從而表現(xiàn)出調(diào)節(jié)代謝的功能。生長(zhǎng)素(auxin)?

生長(zhǎng)素是由色氨酸通過一系列中間產(chǎn)物形成的。?

在植物組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要用來刺激細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)根的分化。?

常用的生長(zhǎng)素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力較弱。NAA、IBA是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。2，4—D起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成。細(xì)胞分裂素（Cytokinin）?

細(xì)胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然狀態(tài)下分裂素主要在根中形成；莖端、種子、果實(shí)也能合成分裂素。?

分裂素的生理作用主要是誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖。在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。?

主要有激動(dòng)素（KT）、6-芐基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基腺嘌呤。其中ZT活性最強(qiáng)，但昂貴；常用的是6—BA。植物激素控制器官形成1956年米勒（Miller）與斯庫格（Skoog）提出生長(zhǎng)素分裂素高：利于根和愈傷組織形成低:

有利于芽的形成適中：有利于根芽的分化（4）培養(yǎng)基及分類?

富鹽平衡培養(yǎng)基：是目前使用最廣泛的一類，代表性的培養(yǎng)基有MS、LS、BL、BM、ER等。特點(diǎn)是：無機(jī)鹽濃度高，微量元素種類齊全，濃度高；元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營(yíng)養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時(shí)無需再加入有機(jī)成分。?

中鹽培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有Nitsch、Miller、Blaydes、H。大多是在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)。特點(diǎn)是：大量元素?zé)o機(jī)鹽為MS的一半，微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比MS增多，例如增加了生物素、葉酸等。?

低鹽培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有

White、WS、HE、HB。特點(diǎn)是：無機(jī)鹽、有機(jī)成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。?

高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有B5、N6、SH。特點(diǎn)是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。

4.植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑?

（1）器官發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞→愈傷組織→出根出芽→

完整植株。?

（2）體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞→分生細(xì)胞→胚狀體

→完整植株。以胡蘿卜為例器官發(fā)生途徑?

（1）啟動(dòng)期：?jiǎn)?dòng)誘導(dǎo)外植體細(xì)胞脫分化和分裂。培養(yǎng)基中添加一定濃度、種類和比例的外源激素刺激外植體細(xì)胞改變?cè)瓉淼拇x途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞活化，重新獲得分裂能力。需要選擇合適的較高濃度的生長(zhǎng)素誘導(dǎo)劑（如NAA、IAA、2-4D等）或細(xì)胞分裂素啟動(dòng)誘導(dǎo)外植體細(xì)胞脫分化和分裂。?

（2）愈傷組織誘導(dǎo)：即細(xì)胞開始分裂并不斷增生子細(xì)胞的過程。這個(gè)階段一般需要降低激素濃度，有些情況下甚至不需要生長(zhǎng)素和分裂素。?

（3）擬分生組織的形成：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到有利于有序生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)部開始發(fā)生一系列形態(tài)和生理變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。在若干部位出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群，通常稱為“生長(zhǎng)中心”，又可稱為“擬分生組織”。該過程是器官發(fā)生的一個(gè)轉(zhuǎn)變時(shí)期。?

（4）器官原基和器官的形成：擬分生組織形成后，一些細(xì)胞分化成為管狀細(xì)胞，進(jìn)而形成維管組織，形成不同的器官原基，進(jìn)一步分化出相應(yīng)的組織和器官。調(diào)節(jié)激素比例，促進(jìn)生根、發(fā)芽。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑?

體細(xì)胞胚（Somatic

embryo）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而形成的胚胎類似物。?

體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：是指體細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程。體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，因此不同于合子胚。（1）器官外植體直接發(fā)生途徑?

莖表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體分化細(xì)胞經(jīng)過脫分化后均可以產(chǎn)生胚狀體。以葉片為外植體直接形成體細(xì)胞胚為例，一般經(jīng)過兩個(gè)階段：?

1）誘導(dǎo)期。葉片表皮細(xì)胞或亞表皮細(xì)胞感受刺激后進(jìn)入分裂狀態(tài)，形成小的瘤狀突起；?

2）胚胎發(fā)育期。瘤狀物繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)過球形胚、心形胚等階段最后形成體細(xì)胞胚

。?

（2）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生途徑：在懸浮培養(yǎng)的細(xì)

胞中一些細(xì)胞可以產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，一個(gè)胚性細(xì)

胞團(tuán)可以發(fā)育成一個(gè)胚狀體，也可以產(chǎn)生多個(gè)胚

狀體。這種方式可以得到大量的胚狀體。?

（3）愈傷組織發(fā)生途徑：愈傷組織內(nèi)部或表面

細(xì)胞均可以產(chǎn)生胚狀體。包括三個(gè)階段：???1）誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；2）誘導(dǎo)愈傷組織胚性化；3）體細(xì)胞胚形成。

5.植物組織培養(yǎng)存在的問題?

（1）玻璃化問題?

植物組織培養(yǎng)中，常會(huì)出現(xiàn)一些半透明狀的畸形

試管植物，這類植物體被稱為“玻璃苗”，這種

現(xiàn)象稱為玻璃化（Vitrification）現(xiàn)象，又稱過

度水化現(xiàn)象。?由于玻璃苗的組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，因此分

化能力低，難以增殖成芽，也難以生根成苗，移

栽大田更難成活，已成為組培的一大問題。?

組織培養(yǎng)過程中試管苗的玻璃化現(xiàn)象主要是適應(yīng)

性的生理問題，是不能很好適應(yīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)

境的結(jié)果。?

（2）褐變問題?

褐變（Browning）可分為酶促褐變和非酶促褐變，主要是酶促褐變。?

酶促褐變是由多酚氧化酶(Polyphenol

oxidase,PPO)催化多酚類化合物，使其發(fā)生氧化形成棕褐色的醌類物質(zhì)和水；醌類物質(zhì)經(jīng)過非酶促聚合，形成黑褐色物質(zhì)(羥醌與黑色素等)，引起褐變的發(fā)生。?

（3）微生物污染?

造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和內(nèi)源菌。?

外部污染菌：主要由外植體帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底以及操作人員操作不慎造成。?

內(nèi)源菌：外植體帶菌引起的污染與外植體的種類、取材季節(jié)、部位、預(yù)處理及消毒方法等密切相關(guān)。?

應(yīng)該嚴(yán)格按照無菌操作，取材時(shí)應(yīng)選擇嫩梢、新芽或胚作為外植體材料，對(duì)外植體進(jìn)行徹底消毒。（4）品種限制目前被子植物組織培養(yǎng)成功的比較多。裸子植物很難脫分化誘導(dǎo)成具有全能性的細(xì)胞，因此組織培養(yǎng)成功的比較少。對(duì)于人工誘導(dǎo)體細(xì)胞的脫分化，不同生物的細(xì)胞脫分化能力不同，決定了組織培養(yǎng)再生的難以。6.

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例寒蘭葉姿碧綠清秀、香氣沁人，是秋冬不可多得的名花，花期35－50天培養(yǎng)技術(shù)注意愈傷組織誘導(dǎo)、發(fā)芽、生根過程中激素等調(diào)節(jié)