酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)

第五章酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)酶的固定化細(xì)胞及細(xì)胞器的固定化固定化酶（細(xì)胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)第一節(jié)酶的固定化水不溶性載體水溶性酶水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)固定化酶是指借助于物理或化學(xué)方法，將酶固定在載體上，并在一定的空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體。固定化酶的特點(diǎn)穩(wěn)定性提高，使用壽命延長(zhǎng)可得到高純度、高產(chǎn)量的產(chǎn)品可以連續(xù)化生產(chǎn)操作反應(yīng)的最優(yōu)化控制成為可能再生產(chǎn)利用缺點(diǎn)酶活力有一定損失，初始的投資大。只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜。與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定。一、酶的固定化方法1．物理吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。載體類別：天然無(wú)機(jī)載體：活性炭，硅藻土，硅膠等。有機(jī)載體：淀粉，纖維素，谷膠原等。

2、包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。分為：（1）網(wǎng)格型（2）微囊型（1）網(wǎng)格型

將酶或含酶菌體包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。載體材料：合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，光敏樹脂天然高分子多糖類：淀粉，明膠，海藻酸，角叉菜膠。

聚丙烯酰胺包埋制備固定化酶的過(guò)程：將酶溶液加入到含有丙烯酰胺（單體）和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）的溶液中，再加入二甲氨基丙腈（加速劑），同時(shí)加入過(guò)硫酸鉀（引發(fā)劑）混合，于25℃保溫10min，即得含酶凝膠，將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒，于低溫儲(chǔ)存或冷凍干燥。（2）微囊型將酶或微生物菌體包埋在高分子半透膜中的微囊內(nèi)稱為微囊型包埋法。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。①界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成膜從而將酶包埋。②界面聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合形成半透膜，將酶包埋于半透膜微囊中。

③二級(jí)乳化法酶溶液先在高聚物（乙基纖維素、聚苯乙烯等）有機(jī)相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次級(jí)乳化液，當(dāng)有機(jī)高聚物固定化后，每個(gè)固體球內(nèi)包含多滴酶液。④脂質(zhì)體包埋法采用雙層脂質(zhì)體形成的極細(xì)球粒包埋酶。3、結(jié)合法通過(guò)選擇適宜的載體，通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法

通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，條件溫和，酶活力回收率高；易受緩沖液種類和pH影響，易脫離。共價(jià)鍵結(jié)合法通過(guò)共價(jià)鍵將酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)與載體的官能團(tuán)結(jié)合的固定化方法?？梢孕纬晒矁r(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵(非活性中心基團(tuán))常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體優(yōu)缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，回收率低，不適用于微生物細(xì)胞固定；不易脫落。首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)關(guān)鍵然后活化該活潑基團(tuán)最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”重氮法疊氮法烷基化反應(yīng)法硅烷化法溴化氰法載體活化的方法①重氮法

是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8∽9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。反應(yīng)示意式如下目前在我們國(guó)內(nèi)用的較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基②疊氮法對(duì)含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶聯(lián)。③溴化氰法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。④烷基化反應(yīng)法

含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。4、交聯(lián)法

借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶交聯(lián)法常用試劑常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來(lái)亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)。雙重固定法吸附交聯(lián)法交聯(lián)包埋法將酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，熱處理也可與交聯(lián)法或其他固定化法聯(lián)合使用，進(jìn)行雙重固定化。5、熱處理法各種固定方法的特點(diǎn)比較復(fù)合載體PEI-SIO2的制備首先對(duì)硅膠進(jìn)行活化處理：取5g硅膠至于30ml甲烷磺酸水溶液控制溫度在102℃，攪拌活化4h，洗滌，抽濾后真空干燥24h即可；然后使硅膠發(fā)生氯丙基化，將活化后的硅膠以二甲苯為溶劑，加入少量的水，與γ-氯丙基三甲氧基硅烷在80℃反應(yīng)6h，抽濾后的產(chǎn)物在索氏抽屜器中用甲苯抽屜24h，以除去γ-氯丙基三甲氧基硅烷，分離后產(chǎn)物經(jīng)真空干燥，所制產(chǎn)物為氯丙基化的硅膠（CP-SIO2）；最后，準(zhǔn)確稱量1g氯丙基化的硅膠，至于一定濃度的聚乙烯亞胺水溶液中，于一定的溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，用大量蒸餾水沖洗產(chǎn)物，抽濾，真空干燥后制得PEI-SIO2復(fù)合載體。稱取0.5g經(jīng)干燥的復(fù)合載體PEI-SIO2，加入適量的戊二醛溶液，攪拌并在室溫條件下反應(yīng)1h，產(chǎn)物用蒸餾水沖洗后抽濾，再加入30ml經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液稀釋過(guò)的脂肪酶液，在恒溫水浴振蕩器中于給出的溫度下震蕩一定的時(shí)間，即可制的固定化的脂肪酶。Table1IndependentvariablesandtheirlevelsforcentralcompositedesignIndependentvariablescodesVariablelevels-10+1MethanolmolarratioX1246Enzymeamount(%)X2369HexaneweightratioX30.30.60.9Temperature(℃)X4304050IndependentvariablescodesVariablelevels-2-10+1+2Enzymeamount(%)X112345Addedwater(v/v)X2246810MethanolmolarratioX323456Reactiontemperature(℃)X42535455565Reactiontime(h)X548121620RunX1X2X3X4Truemodel(%)RSMmodel(%)Error(%)1-1-10047.446.661.562-110055.7453.843.4131-10045.6847.303.554110060.8661.320.75500-1-171.9371.350.81600-1167.9367.980.077001-170.8670.470.068001172.1772.410.339-100-153.7455.583.4210-100154.3754.340.0611100-157.5859.112.6612100159.2758.910.61130-1-1066.0965.950.21140-11054.155.151.941501-1063.4563.980.7416011076.6178.322.2317-10-1046.3445.12.6818-101053.3750.714.981910-1056.4552.996.1320101055.850.938.73210-10-171.4468.683.86220-10170.1566.535.1623010-180.477.843.1824010182.0378.574.2225000089.3589.210.1526000089.6589.210.4927000091.0289.211.99Y=-174.942+53.543X1+9.479X2+127.56X3+4.143X4+0.285X1X2-3.198X1X3+0.013X1X4+6.986X2X3+0.024X2X4+0.442X3X4-6.605X12-1.167X22-142.839X32-0.058X42Fattyacidmethylestercontetnt(%)Rentiontime(min)Content(%)7-Hexadecanoicacidmehtylester(C17H32O2)6.590.72Hexadecanoicacidmehtylester(C17H34O2)6.7314.829,12-Octadecadienoicacidmethylester(C19H34O2)8.1835.799-Octadecadienoicacidmethylester(C19H36O2)8.2440.96Octadecadienoicacidmethylester(C19H38O2)8.457.511-Eicosenoicacidmethylester(C21H40O2)10.260.07Eicosenoicacidmethylester(C21H42O2)10.530.14二、固定化酶的性質(zhì)

1、固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響大多數(shù)情況下，具有較長(zhǎng)的操作壽命和保存壽命。原因：酶固定化使其活性構(gòu)象的牢固性增加，酶分子與載體的多方位連接降低了酶分子的伸展變性。酶固定化能降低自身降解的程度載體的保護(hù)使得酶抗不良環(huán)境因素的影響的能力增強(qiáng)。固定化酶穩(wěn)定性升高表現(xiàn)在：熱穩(wěn)定性增強(qiáng)對(duì)變性劑、抑制劑的耐受性提高對(duì)蛋白酶抵抗能力增加、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。2、最適溫度固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，但有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會(huì)有明顯的變化。1）載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。最適pH值

載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低。4、底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。5、米氏常數(shù)固定化酶的表觀米氏常數(shù)隨載體的帶電性能而變化。（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km三、固定化酶的應(yīng)用1、工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用（1）氨基?；福?）葡萄糖異構(gòu)酶（3）延胡索酸酶2、酶電極 （1）葡萄糖電極 半透膜 酶膠層

感應(yīng)電極

酶電極示意圖葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極第二節(jié)細(xì)胞及細(xì)胞器的固定化細(xì)胞固定化：通過(guò)各種方法將細(xì)胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過(guò)程。固定化活細(xì)胞或固定化增值細(xì)胞：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。一、微生物細(xì)胞固定化固定微生物細(xì)胞時(shí)，操作簡(jiǎn)便易行，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝沒(méi)有明顯的影響，但吸附力較弱，吸附不牢固，細(xì)胞容易脫落。吸附法是制備固定化動(dòng)物細(xì)胞的主要方法，主要是因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞大多數(shù)具有附著特性。吸附法是制備固定化植物細(xì)胞：硅藻土、多空玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料、纖維素等。（2）包埋法將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法（凝膠包埋法、半透膜包埋法）。瓊脂糖凝膠包埋法海藻酸鈣凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法2、固定化微生物細(xì)胞的特點(diǎn)固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。固定化微生物細(xì)胞保持了原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來(lái)的代謝途徑進(jìn)行新陳代謝。發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或連續(xù)使用提高了細(xì)胞密度，提高產(chǎn)率。3、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物。利用固定化微生物細(xì)胞與各種電極結(jié)合制成微生物電極。呼吸活性測(cè)定型傳感器：利用固定在高分子膜上的微生物細(xì)胞的呼吸作用，測(cè)定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測(cè)定物質(zhì)的量。電極活性測(cè)定型傳感器：利用固定在膜上的微生物細(xì)胞的新陳代謝作用，測(cè)定電極活性物質(zhì)的量的變化，從而確定樣品中欲測(cè)物質(zhì)的含量。二、植物細(xì)胞固定化（1）植物細(xì)胞固定化方法吸附法：一般將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁上。包埋法：將植物細(xì)胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠中。（2）固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡(jiǎn)便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，有利于生產(chǎn)各種所需的次級(jí)代謝物。提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定,可連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率.不容易聚集成團(tuán),有利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。（3）固定化植物細(xì)胞的應(yīng)用①制造人工種子細(xì)胞全能理論：在一定的條件下，細(xì)胞會(huì)生長(zhǎng)、繁殖長(zhǎng)成一顆完整的植株。通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以由一粒種子快速繁殖得到大量細(xì)胞，再通過(guò)固定化技術(shù)進(jìn)行人工種子的研制，獲得大量具有相同遺傳特性的植株。

②固定化植物細(xì)胞可以用于生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶等次級(jí)代謝物。（胞外產(chǎn)物）三、動(dòng)物細(xì)胞固定化1、動(dòng)物細(xì)胞固定化的方法①吸附法常用的吸附固定化載體轉(zhuǎn)瓶：由玻璃或塑料制成，其表面經(jīng)過(guò)一定的方法處理可帶上電荷。微載體：顆粒細(xì)小的固定化載體，由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。中空纖維：由聚丙烯