測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題分析與解答

測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題分析與解答1、DNA測(cè)序樣品用什么溶液溶解比較好?答：溶解DNA測(cè)序樣品時(shí)，用滅菌蒸餾水溶解最好。DNA的測(cè)序反應(yīng)也是Taq酶的聚合反應(yīng)，需要一個(gè)最佳的酶反應(yīng)條件。如果DNA用緩沖液溶解后，在進(jìn)行了測(cè)序反應(yīng)時(shí)，DNA溶液中的緩沖液組份會(huì)影響測(cè)序反應(yīng)的體系條件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客戶在溶解DNA測(cè)序樣品時(shí)使用TEBuffer。的確，TEBuffer能增加DNA樣品保存期間的穩(wěn)定性，但TEBuffer對(duì)DNA測(cè)序反應(yīng)有影響，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，我們還是推薦使用滅菌蒸餾水來(lái)溶解DNA測(cè)序樣品。2、提供DNA測(cè)序樣品時(shí)，提供何種形態(tài)的比較好？答：我們推薦客戶提供菌體，由我們來(lái)提取質(zhì)粒，這樣DNA樣品比較穩(wěn)定。如果您要以提供DNA樣品，我們也很歡迎，但一定要注意樣品純度和數(shù)量。提供的測(cè)序樣品為PCR產(chǎn)物時(shí)，特別需要注意DNA的純度和數(shù)量。PCR產(chǎn)物應(yīng)該進(jìn)行切膠回收，否則無(wú)法得到良好的測(cè)序效果。有關(guān)DNA測(cè)序樣品的詳細(xì)情況請(qǐng)嚴(yán)格參照“DNA測(cè)序樣品準(zhǔn)備及注意事項(xiàng)”部分的說(shuō)明。3、提供的測(cè)序樣品為菌體時(shí)，以什么形態(tài)提供為好？答：一般菌體的形態(tài)有：平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養(yǎng)菌或新鮮菌液。平板培養(yǎng)菌運(yùn)送特別不方便，我們收到的一些平板培養(yǎng)菌的培養(yǎng)皿在運(yùn)送過(guò)程中常常已經(jīng)破碎，面目全非，需要用戶重新寄樣。這樣既誤時(shí)間，又浪費(fèi)客戶的樣品。一旦是客戶非常重要的樣品時(shí)，其后果更不可設(shè)想。而甘油保存菌則容易污染。制作穿刺菌時(shí)，可在1。5ml的Tube管中加入瓊脂培養(yǎng)基，把菌體用牙簽穿刺于瓊脂培養(yǎng)基(固體)中，37℃培養(yǎng)一個(gè)晚上后便可使用。穿刺培養(yǎng)菌在4℃下可保存數(shù)個(gè)月，并且不容易污染，便于運(yùn)送。4、與測(cè)序引物有關(guān)的問(wèn)題：答：對(duì)于通用測(cè)序引物，只要正確使用，一般不會(huì)有太大問(wèn)題，測(cè)序引物問(wèn)題主要發(fā)生在客戶自己提供的PCR引物上。應(yīng)該明確的一點(diǎn)是并不是所用的用于PCR的引物都可以用來(lái)作測(cè)序，以下幾種PCR引物將是不適合用作測(cè)序引物的:(1)簡(jiǎn)并引物，簡(jiǎn)并引物必然要在測(cè)序模板上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，直接影響測(cè)序結(jié)果。⑵隨機(jī)引物，如RAPD引物，隨機(jī)引物一般都比較短，所用退火溫度低，在測(cè)序反應(yīng)的條件下，不能很好地與模板結(jié)合。⑶過(guò)長(zhǎng)的引物，一般要求測(cè)序引物不大于24bp,最長(zhǎng)不能超過(guò)30bp。過(guò)長(zhǎng)的引物在測(cè)序反應(yīng)的較低的條件下容易在測(cè)序模板上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果背景增高。另外，較長(zhǎng)的引物純度也將難以保證。通常用于測(cè)序的引物純度要在90%以上，引物純度低時(shí)，測(cè)序反應(yīng)的背景將明顯增大，直接影響到測(cè)序結(jié)果。(4)有特殊標(biāo)記的引物，該情況主要指熒光標(biāo)記的引物。我們測(cè)序反應(yīng)的四種堿基都是熒光標(biāo)記的，這樣，熒光標(biāo)記的引物將產(chǎn)生干擾。另外，其他一些有大的標(biāo)記基團(tuán)的引物也最好不要用于測(cè)序。引物上大的標(biāo)記基團(tuán)將直接影響到DNA片段的遷移率，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果峰型不好或錯(cuò)誤。(5)不純的引物，測(cè)序引物對(duì)純度的要求很高，合成的引物中非全長(zhǎng)的片段可以造成較強(qiáng)的背景。以一個(gè)20bp的測(cè)序引物為例，直接脫鹽純化的話，純度至多在70%左右，也就是說(shuō)將有30%的引物將作為背景噪音，這必將嚴(yán)重影響測(cè)序結(jié)果。一般經(jīng)PAGE或OPC法純化的引物基本能達(dá)到測(cè)序的要求。5、怎樣選擇(設(shè)計(jì))測(cè)序用引物？答：測(cè)序用引物要求非常嚴(yán)格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結(jié)合，3′端的幾個(gè)堿基能完全配對(duì)，即使引物長(zhǎng)達(dá)80?100多個(gè)堿基，只要調(diào)整PCR反應(yīng)條件，也能成功進(jìn)行PCR反應(yīng)。而測(cè)序用引物便不一樣了，必須嚴(yán)格符合以下要求。本公司的測(cè)序用引物全用引物設(shè)計(jì)軟件Primer設(shè)計(jì)。在本公司測(cè)序時(shí)，我們可免費(fèi)幫助設(shè)計(jì)測(cè)序用引物。⑴長(zhǎng)度在15?25個(gè)堿基左右，一般選擇20個(gè)堿基(根據(jù)GC含量作適當(dāng)調(diào)整)，(2)3’端盡量選擇G或C堿基(但不絕對(duì))，以增加與模板的結(jié)合能力。(3)Tm溫度應(yīng)選擇50℃~70℃左右。(4)GC含量應(yīng)選擇在50%左右，盡量避開(kāi)A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu)。(5)避開(kāi)引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。(6)保證引物和模板100%匹配，特別是3’端的幾個(gè)堿基一定要100%匹配。同時(shí)必須嚴(yán)格保證引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

6、PCR片段直接測(cè)序和PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序的結(jié)果有何區(qū)別？答:眾所周知，PCR壙增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)配現(xiàn)象，但不可能所有的錯(cuò)配都發(fā)生在同一位置。PCR片段直接測(cè)序時(shí)，其結(jié)果是PCR片段眾多分子的混合物的結(jié)果。如果在某一個(gè)點(diǎn)上出現(xiàn)了幾十次錯(cuò)配現(xiàn)象，但大多數(shù)分子（或許是幾十萬(wàn)個(gè)分子）在這個(gè)點(diǎn)上應(yīng)該還是正確的，在測(cè)序時(shí)，錯(cuò)配現(xiàn)象也就是反映不出來(lái)了。因此，PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果反映的是PCR用模板最原始的結(jié)果。而PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序是測(cè)定了某一個(gè)分子的DNA序列。在幾十個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，很難保證某一個(gè)分子的任何點(diǎn)都不發(fā)生錯(cuò)配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測(cè)序結(jié)果，往往存在著一些錯(cuò)配的序列，和PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果相比有些堿基會(huì)有所不同。這種錯(cuò)配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時(shí)使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時(shí)，請(qǐng)選用保真性能高的DNA聚合酶。7、測(cè)序結(jié)果不到800Bases，還照常收費(fèi)了，為什么？答：如在DNA樣品中的DNA序列分布勻稱，沒(méi)有復(fù)雜結(jié)構(gòu)時(shí)，正常的測(cè)序反應(yīng)能保證達(dá)到800Bases以上。但有一些DNA樣品立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造成聚合酶延伸反應(yīng)終止，測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失，或者測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因由DNA模板本身所造成（公司保證進(jìn)行2次以上的測(cè)序工作）。對(duì)這些結(jié)果，公司會(huì)根據(jù)具體測(cè)序情況，進(jìn)行收費(fèi)（詳細(xì)見(jiàn)收費(fèi)約定）。出現(xiàn)這些情況的原因分析如下：（1）G/Crich、G/CCluster。這種情況一般表現(xiàn)為測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失（圖1，圖2）圖1G/Crich引起的信號(hào)減弱WW九 的 融 口I III III圖2G/Crich引起的信號(hào)消失ICICIICICIAIGIG^1IGIGIGIAIcIGIrIcITcIGmlIGIcIGIGIGg—IAIcIcIG^1A"IIc(G(GIA(2)A,T的連續(xù)結(jié)構(gòu)。這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰。根據(jù)文獻(xiàn)記載。原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識(shí)別完整的每個(gè)A或T，在某個(gè)A或T的后面便開(kāi)始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)(打滑現(xiàn)象)，造成測(cè)序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。一般在多少個(gè)A或T的后面能出現(xiàn)這種情況呢？現(xiàn)在還沒(méi)有這方面的報(bào)道。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，這一情況的出現(xiàn)和A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列的排列情況有著直接的關(guān)系。有時(shí)10多個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面便出現(xiàn)套峰，但有時(shí)60?70個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列也一樣可以完整地讀出來(lái)。具體情況還有待考證。一般來(lái)說(shuō)，PCR片段直接測(cè)序時(shí)，A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列測(cè)序結(jié)果都會(huì)出現(xiàn)套峰。原因在于測(cè)序時(shí)經(jīng)歷了PCR反應(yīng)及測(cè)序反應(yīng)(測(cè)序反應(yīng)本身也是PCR反應(yīng))二次聚合酶的打滑現(xiàn)象。圖3polyA引起的套峰(3)原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)突然信號(hào)減弱或消失。從序列上看，DNA堿基排列并無(wú)特別異常。估計(jì)是DNA整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從某一位置開(kāi)始聚合酶的聚合反應(yīng)便無(wú)法進(jìn)行。圖4復(fù)雜結(jié)構(gòu)引起的信號(hào)中斷ICICIAIGIGICICIAIGIG^1IGIGIGICIGTIGIGIAICIG15.—1ITIcIT^1cIGno—IGIcIGIGIG?IIAIcIcIG^1A收—IcIGIGIA8、出現(xiàn)套峰的原因是什么？答：在測(cè)序反應(yīng)中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結(jié)其形成原因有以下幾點(diǎn)：（1）測(cè)序引物在模板上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖5）；（2）模板不純，如果是質(zhì)?；蚴蔷海蚴欠菃慰寺。▓D6），為非特異性條帶（圖7）；（3）模板序列的特殊結(jié)構(gòu)，如poly結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等（圖8）；（4）引物降解，或引物不純（圖9，圖10）。（5）信號(hào)值過(guò)低或無(wú)信號(hào)（圖11）。圖5雙引物結(jié)合位點(diǎn)引起的套峰如果是PCR,原因TAAGTTCGAAlK圖6由于質(zhì)粒或菌液為非單克隆引起的套峰圖7PCR為非特異性條帶引起的套峰圖8模板特殊結(jié)構(gòu)引起的套峰I-圖7PCR為非特異性條帶引起的套峰圖8模板特殊結(jié)構(gòu)引起的套峰I-圖9引物輕微降解或引物不純引起的套峰圖10引物嚴(yán)重降解或引物不純引起的套峰圖11測(cè)序信號(hào)值太弱或無(wú)信號(hào)引起的套峰9、我為什么找不到我的PCR引物？答：以下幾種情況，我們將無(wú)法找到做PCR時(shí)的引物序列(1)用PCR引物作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，所測(cè)序列是從引物3’末端后第一個(gè)堿基開(kāi)始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有兩種方法可以得到您的引物序列。對(duì)于較短的PCR產(chǎn)物(<800bp)，可以用另一端的引物進(jìn)行測(cè)序，從另一端測(cè)序可以一直測(cè)到序列的末端，就可以在序列的末端得到的引物的反向互補(bǔ)序列。對(duì)于較長(zhǎng)的序列，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)不到頭，因此就只能將您的PCR產(chǎn)物片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，用載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測(cè)序的起始端總會(huì)有一些堿基無(wú)法準(zhǔn)確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測(cè)序。(2)PCR產(chǎn)物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機(jī)的，因此，當(dāng)您在一條鏈上找不到您的引物序列時(shí)，試圖在互補(bǔ)鏈上尋找您的引物序列。(3)當(dāng)測(cè)序引物離您的插入片段很近時(shí)，有時(shí)可能也無(wú)法找到您的引物的全序列。這主要是因?yàn)橛袝r(shí)序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區(qū)的序列不好，可能無(wú)法找到您的引完整序列。(4)有時(shí)，質(zhì)粒做模板進(jìn)行測(cè)序時(shí)，由于某些原因，質(zhì)粒上沒(méi)有插入外援片段，為空載體，所測(cè)的序完全為載體序列，此時(shí)自然也找不到引物序列。10、我的基因序列與標(biāo)準(zhǔn)序列為什么有差別？答：一段基因序列經(jīng)擴(kuò)增后，克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序。在兩個(gè)層次上可能導(dǎo)致序列發(fā)生變化。首先在PCR擴(kuò)增過(guò)程中就可能產(chǎn)生錯(cuò)誤。將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變。其次，測(cè)序的準(zhǔn)確率問(wèn)題。ABI公司承諾其儀器的測(cè)序精度在一定范圍內(nèi)可以達(dá)到98。5%以上。由于儀器準(zhǔn)確率的限制，在一個(gè)較長(zhǎng)的序列中發(fā)生堿基序列錯(cuò)誤是難以避免的。在確認(rèn)克隆無(wú)誤的情況下，通過(guò)雙向測(cè)序可以最大限度減少測(cè)序的錯(cuò)誤。您如果想得到您的最準(zhǔn)確的序列，進(jìn)行雙向測(cè)序是很有必要的。只進(jìn)行簡(jiǎn)單的單向測(cè)序，我們無(wú)法保證所測(cè)序列的完全準(zhǔn)確性，這是由儀器的精度決定的。11、過(guò)短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測(cè)序？答：首先過(guò)短的PCR產(chǎn)物純化困難，一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒都要求PCR產(chǎn)物片段大于150bp，過(guò)短的PCR產(chǎn)物純化和準(zhǔn)確定量都非常困難。因此我們要求用于測(cè)序的PCR產(chǎn)物一般不低于150bp長(zhǎng)度。其次，由于測(cè)序技術(shù)本身的限制，測(cè)序反應(yīng)對(duì)環(huán)境的干擾比較敏感，模板太短的PCR測(cè)序受外界的干擾更大，很容易造成測(cè)序失敗。12、用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變可靠嗎？答：有的客戶想用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變體，我認(rèn)為該方法可靠性不高。主要有以下兩個(gè)原因。首先，們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測(cè)出來(lái)。只有當(dāng)測(cè)序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時(shí)，才能較可靠地檢測(cè)到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號(hào)強(qiáng)度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在。另外，測(cè)序儀是設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)序正常的堿基序列的，軟件在對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。因此，當(dāng)某處出現(xiàn)雙峰時(shí)，測(cè)序儀一般會(huì)認(rèn)為信號(hào)弱的峰為背景信號(hào)，在處理過(guò)程中，將弱的峰進(jìn)一步壓低，這樣根部不立于突變體的檢測(cè)。因此認(rèn)為，用測(cè)序的方法檢測(cè)突變體的存在不是一個(gè)好的方法。13、我要求5’到3’正向測(cè)序，為什么你們給我的序列是反的？答：您指的可能是插入片段的方向，而我們并不清楚您的樣品是如何構(gòu)建的。我們只能根據(jù)質(zhì)粒上的序列來(lái)確定測(cè)序方向，所以在測(cè)序引物一欄中請(qǐng)不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣，因?yàn)槲覀兪种械馁Y料在注明方向時(shí)可能和您手中的資料方向相反，請(qǐng)以T7,T3,SP6,M13f,M13r這樣的形式來(lái)填寫(xiě)，或注明酶切位點(diǎn)方向比如“測(cè)序方向EcoRI到Hindlll”。我們手中等質(zhì)粒資料有限，有時(shí)還需要您提供質(zhì)粒的相關(guān)資料。14、我的樣品在你們所說(shuō)的可靠范圍內(nèi)有一處存在疑問(wèn)，能否重新測(cè)一次？答：我們希望您能夠告訴我們存在疑問(wèn)的位點(diǎn)的位置，如果從測(cè)序報(bào)告上的確無(wú)法作出準(zhǔn)確判讀，我們會(huì)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果您指出的位點(diǎn)信號(hào)清晰準(zhǔn)確，您仍然要求再進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，那么實(shí)驗(yàn)結(jié)果和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是相同的。15、我的樣品送測(cè)序前已經(jīng)鑒定過(guò)了，有插入片段的，為什么你給我的測(cè)序結(jié)果是一個(gè)空質(zhì)粒？答：造成這種現(xiàn)象主要有兩個(gè)原因。(1)鑒定過(guò)程中的假陽(yáng)性。鑒定插入片段主要是通過(guò)PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應(yīng)受多種條件的影響，在鑒定過(guò)程中易產(chǎn)生假陽(yáng)性，而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。(2)我們由于條件的限制，無(wú)法單獨(dú)的對(duì)某一個(gè)客戶的樣品進(jìn)行特定條件的培養(yǎng)，所以可能在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生插入片段的丟失。由于這種情況的發(fā)生無(wú)法事先預(yù)期到，所以我們也只能對(duì)出現(xiàn)這樣情況的客戶說(shuō)抱歉。直接提供質(zhì)粒雖然可以避免這樣的情況，但由于質(zhì)粒制備上的問(wèn)題，測(cè)序的成功率可能會(huì)受到影響。16、DNA片段很長(zhǎng)，一個(gè)反應(yīng)讀不到頭，怎么辦？答：如果DNA片段在載體上，可以用載體上兩端的引物同時(shí)測(cè)序，讓其中間交叉互補(bǔ)，便可完全測(cè)通。如果這樣還讀不通，可在已經(jīng)測(cè)出序列的450?500個(gè)堿基處設(shè)計(jì)測(cè)序引物作進(jìn)一步測(cè)序（此稱為PrimerWalking法），便可完全測(cè)序。17、我的樣品你們已經(jīng)測(cè)通了，但為什么在overlap區(qū)有這么多的錯(cuò)配，給出的全序列和單個(gè)報(bào)告也稱作差異，我該相信誰(shuí)？答：給出的全序列是一個(gè)拼接的結(jié)果，當(dāng)互相拼接的兩個(gè)序列存在差異時(shí)，應(yīng)該以序列質(zhì)量更好的應(yīng)該為主，這也就是為什么會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配和全序列與單個(gè)測(cè)序結(jié)果的差異。18、