第三章病毒感染力的滴定2013

第三章病毒感染力的滴定半數(shù)致死量LD50（50%lethaldose）半數(shù)感染量ID50(50%infectivedose)半數(shù)雞胚致死量ELD50(egg50%lethaldose)半數(shù)雞胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蝕斑形成單位（plaqueformingunit，PFU）測(cè)定病毒感染力的方法:將病毒作一定梯度的連續(xù)稀釋后接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞，每一稀釋度作多個(gè)重復(fù)，在一定時(shí)間內(nèi)，記錄動(dòng)物（雞胚）發(fā)病或死亡的數(shù)量或細(xì)胞病變的情況，利用Reed-Muench法或Karber法計(jì)算病毒的感染力。測(cè)定病毒感染力的基本過(guò)程:一、病毒TCID50的測(cè)定操作步驟在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細(xì)胞懸液100μl，使細(xì)胞量達(dá)到3×105個(gè)/ml。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法10-110-210-310-410-510-610-710-8TCID50的計(jì)算方法（CalculationofTCID50）病毒液出現(xiàn)無(wú)CPE累計(jì)出現(xiàn)CPE孔稀釋度

CPE孔數(shù)孔數(shù)CPE孔數(shù)無(wú)CPE孔數(shù)所占的%10-180510100（51/51）

10-280430100（43/43）

10-380350100（35/35）

10-480270100（27/27）

10-580190100（19/19）

10-67111191.7（11/12）

10-7354640（4/10）

10-8171137.1（1/14）

1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8lgTCID50=距離此例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)

=0.8×(-1)+(-6)=-6.8TCID50=10-6.8／0.1ml含義：將該病毒稀釋106.8倍接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，可使50%接種孔的細(xì)胞發(fā)生病變。

2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率

10-188/8=110-288/8=110-38

8/8=110-488/8=110-58

8/8=110-67

7/8=0.87510-73

3/8=0.37510-811/8=0.125lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高濃度的稀釋度的對(duì)數(shù)D：稀釋度對(duì)數(shù)之間的差S：陽(yáng)性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6.875/0.1ml二、病毒蝕（噬）斑技術(shù)病毒蝕斑（plaque)

又稱空斑，指病毒在已長(zhǎng)成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶。原理：適當(dāng)稀釋的病毒懸液接種已經(jīng)長(zhǎng)成單層的敏感細(xì)胞后，在覆蓋的固體或半固體介質(zhì)（瓊脂糖、甲基纖維素）的作用下，病毒在最初感染的細(xì)胞內(nèi)增殖后，只能進(jìn)而感染并破壞臨近的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期后，形成一個(gè)局限性的肉眼可見(jiàn)的病變細(xì)胞區(qū)，即局限性的病灶。plaquesProcedures操作步驟將敏感細(xì)胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當(dāng)稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細(xì)胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細(xì)胞單層為宜，每個(gè)稀釋度接種2-3孔。（一）用瓊脂糖覆蓋，中性紅染色將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，融化后降溫至38-42℃，與等量預(yù)熱至38-42℃含6%-10%犢牛血清的無(wú)酚紅DMEM混合，注入細(xì)胞培養(yǎng)板中。室溫放置直至瓊脂糖凝固，或于4℃冰箱放置幾分鐘至瓊脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。出現(xiàn)空斑后（2-3天），用含鈣、鎂的PBS將0.1%的中性紅貯存液10倍稀釋后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板上。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用1h，吸棄染液，繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)2-3h。TK-突變株與野毒形成的空斑的比較（二）用甲基纖維素覆蓋，結(jié)晶紫染色將敏感細(xì)胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層。吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當(dāng)稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細(xì)胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細(xì)胞單層為宜，每個(gè)稀釋度接種2-3孔。將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。覆蓋配好的4%羧甲基纖維素鈉（含3%新生牛血清）。48-72h后，待細(xì)胞出現(xiàn)病變或蝕斑時(shí)，各孔補(bǔ)滿10%中性甲醛，固定4h以上。棄掉孔中液體，流水側(cè)板沖洗數(shù)次。各孔補(bǔ)加配好的結(jié)晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。棄掉染液，繼續(xù)沖洗數(shù)次，在37℃溫箱中敞口烘干，顯微鏡下計(jì)空斑數(shù)。蝕斑技術(shù)的應(yīng)用：用于病毒純化：挑選病毒的克隆株測(cè)定病毒懸液中感染病毒的含量如果是作病毒純化

挑取空斑于200μL維持液中，反復(fù)凍融3次，接種于PK-15細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至完全發(fā)生病變。一般的毒種純化：收集病變的細(xì)胞懸液，通過(guò)PCR或其它方法進(jìn)行鑒定，并測(cè)定TCID50，然后選TCID