顯微操作技術

顯微操作技術

生命科學學院

楊東

QQ1034683507第1章顯微技術發(fā)展歷史1.1.1生物學顯微技術的概念:

是基于生物學理論知識,以生物體為材料,在光學顯微鏡觀察的范圍內所開展進行的實驗操作技術.1.1.2顯微鏡的發(fā)明史★十六世紀的顯微鏡★十七世紀顯微鏡鏡★十八世紀的顯微鏡★十九世紀的顯微鏡★二十世紀的顯微鏡★未來的顯微鏡

“昨天，今天和明天”十六世紀的顯微科學

十六世紀單式顯微鏡十六世紀復式顯微鏡

第一個復式顯微鏡:詹森顯微鏡十七世紀的顯微科學

單式顯微鏡的發(fā)展

單式顯微鏡有一個致命的缺點,它的焦距與透鏡直徑成正比,與放大倍數成反比。也就是說,焦距越短,放大倍數越大,而透鏡直徑又越小。如果放大倍數是100倍,透鏡的焦距為0.25毫米,透鏡直徑大約為0.33毫米。這個比大頭針頭還小的透鏡在當時根本制造不出來。因此,當時的放大鏡的放大倍數最多不過25倍。列文虎克和他的顯微鏡（約1680）

單式顯微鏡的頂峰----列文虎克的顯微鏡

AntonivanLeeuwenhoek(1632-1723)荷蘭代爾夫特人，是生物學發(fā)展史上的一位重要人物，一位僅僅受過初級教育的天才科學家和顯微鏡制造者。他一生親自磨制了550個透鏡，裝配了247架顯微鏡，為人類創(chuàng)造了一批寶貴的財富，至今保留下來的有9架。他最先發(fā)現了細菌，從而開創(chuàng)了微生物學。

復式顯微鏡在性能上明顯優(yōu)于單式顯微鏡。一是它的放大率可以做得很高,可以把幾個放大倍數較小的凸透鏡組合起來獲得很高的放大率。二是制造工藝較簡單,不必磨制一個個極小的透鏡。復式顯微鏡的發(fā)明,是科學史上的里程碑,人類從此開始認識微觀世界。

伽利略的顯微鏡胡克的顯微鏡十八世紀的顯微科學

十八世紀是歐洲科學復蘇的時期,各種新的科學理論層出不窮。由于不被人十分重視,十八世紀的復式顯微鏡發(fā)展很慢,但仍然做出了一些漂亮的顯微鏡。這類顯微鏡的特色在于:

(1)新式底座。

(2)獨特鏡臂結構。

(3)當時最先進的聚光方法。

卡夫(Cuff)顯微鏡

Cuff顯微鏡的功能在當時是最多的.它有三種性能:透射觀察,落射觀察和活體觀察.其中,活體觀察功能是在當時復式顯微鏡中特有的。

Cuff顯微鏡是當時最好的復式顯微鏡.

Cuff-Style顯微鏡Wales顯微鏡Chest顯微鏡

歷史上最豪華的顯微鏡:英王GeorgeIII的銀顯微鏡。十九世紀的顯微科學

十九世紀，隨著工業(yè)革命的進行，顯微科學也同其它學科一起飛速發(fā)展起來。其主要的原因是機械的使用使透鏡的質量大大提高和光學的發(fā)展使顯微鏡的結構更加符合光學原理。Ladd的學生顯微鏡

英國人WilliamLadd在1864年制造，采用了當時最先進的齒輪調焦裝置

這個顯微鏡的鏡臂上多出了一個在前幾個世紀的顯微鏡上都看不到的東西----聚光鏡

十九世紀的顯微鏡是今天光學顯微鏡的雛形wenham顯微鏡由英國倫敦人FrancisWenham在1882年制造。有著當時最為精巧先進的齒輪傳動系統(tǒng)和齒輪調焦系統(tǒng),聚光系統(tǒng)還有成像系統(tǒng)。是十九世紀中性能最好的顯微鏡,也是歷史上最精美的顯微鏡。Nachet偏振光顯微鏡

最早消除色差的顯微鏡之一最早的偏振光顯微鏡之一二十世紀的顯微科學

由于人們在物理，數學和材料科學等領域取得了非常大的進展，顯微鏡的質量大大提高。各種新型的顯微鏡也應運而生。各種新技術也相繼出現。數字成像技術開始了用計算機來處理傳送顯微影象的時代，使人們記錄顯微影象的方式又前進了一步。1.明場顯微鏡2.暗場顯微鏡3.相襯顯微鏡4.偏光顯微鏡5.干涉顯微鏡6.紫外顯微鏡7.熒光顯微鏡8.體式顯微鏡熒光顯微鏡

利用強烈的經過慮光器過濾的激發(fā)光線（紫外光或藍紫光）激發(fā)標本（經過熒光染色或沒有）產生熒光進行觀察的一種顯微鏡。優(yōu)點：成像對比強烈，色彩鮮艷，分辨率高，可以觀察到一般不可見的物質（如DNA等分子）的分布情況等?，F廣泛用于免疫熒光技術和基因芯片技術。另一種熒光顯微鏡偏光顯微鏡萬能研究顯微鏡功能繁多：有明視野，暗視野，相差，偏振，微分干涉，熒光，顯微攝影等等，有的還具有顯微操作的功能。是一種高檔次的顯微鏡。萬能研究顯微鏡

laserconfocalscanningmicroscope,LCSM未來顯微鏡的發(fā)展一、拍得更清晰二、放大倍數更高三、更為人性化的設計四、一體化的顯微鏡五、專門的網絡化顯微鏡六、光源的革新

一、拍得更清晰顯微鏡廠商為此開發(fā)出各種各樣的顯微鏡鏡頭來消除各種色差和場曲。最近，在顯微鏡上普遍采用了UIS2光學系統(tǒng)，它充分體現了無限遠校正方式的優(yōu)越性。UIS2無限遠光學系統(tǒng)的物鏡具有在寬波長范圍內（由紫外至近紅外區(qū)）具有一致的高透過率。同時具有更高的信噪比，不需要額外補償就可以得到更為清晰的圖像。二、放大倍數更高通常情況下，目鏡的放大倍數為10倍或者16倍。以40倍物鏡為例，也不過是放大400倍或者是640倍，如今卻能夠將放大倍數提高到840倍。例如美國AMG公司開發(fā)的倒置顯微鏡，在物鏡下采用了21倍的光學放大，使得我們能夠通過40倍的物鏡就可以觀察到放大倍數更高的圖像了。如果換成100倍的油鏡，就可以通過顯示器觀察到放大到驚人的2100倍甚至更高的圖像，無不讓人贊嘆技術的發(fā)展之快。

三、更為人性化的設計

四、一體化的顯微鏡

也許現在我們接觸到的顯微鏡大多是機械式的，需要手動來調焦距、調光源、調樣品的位置，特別是針對細胞培養(yǎng)，出現了大量連續(xù)培養(yǎng)過程中顯微觀察的要求。為此，各個顯微鏡廠商設計了能夠用于連續(xù)培養(yǎng)顯微觀察的顯微鏡或配件五、專門的網絡化顯微鏡Nikon公司的Coolscope和Leica公司的DMD108為臨床遠程病理會診提供了方便，它們專門為載玻片顯微觀察設計，自動轉換物鏡，自動對焦，得到的圖像可直接通過網絡發(fā)送到異地進行專家會診。六、光源的革新

對于熒光顯微鏡，到現在為止絕大多數顯微鏡還在使用鹵鎢燈或者是高壓汞燈，一方面這類光源使用壽命短，需要3到4各月更換一次，每次更換后都需要專業(yè)工程師進行位置校準；另外一方面，這類光源的強度會隨著使用壽命而衰減；還有一方面，這類光源對于顯微鏡操作來說需要預熱來等待光源強度穩(wěn)定，而且光源關閉后需要等待30分鐘左右才能重啟.

總觀光學顯微科學四百多年的歷史,顯微科學也得到了飛速發(fā)展。我們可以看到,任何一個學科的發(fā)展都離不開其它學科的支持。1.2顯微解剖切片機發(fā)展史“切出精彩”生物切片機已發(fā)展成為五大系列上百個品種,即①旋轉式切片機

、②滑行式切片機

、③冰凍切片機、④振動切片機、⑤超薄切片機。

1.3染色技術發(fā)展史1.3.1顯微技術的用具及其方法演進載玻片

蓋玻片染色缸1.3.2染色技術發(fā)展史

天然染料人工染料

單染雙重染色三重染色四重染色

第2章顯微鏡及其附加設備一．顯微鏡的光學性能

透鏡是組成顯微鏡光學系統(tǒng)的最基本的光學元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。

三．影響成像的關鍵因素—相差

由于客觀條件，任何光學系統(tǒng)都不能生成理論上理想的象，各種象差的存在影響了成像質量。下面分別簡要介紹各種相差。

1．色差（Chromaticaberration）

色差是透鏡成像的一個嚴重缺陷，發(fā)生在多色光為光源的情況下，單色光不產生色差。白光由紅橙黃綠青藍紫七種組成，各種光的波長不同，所以在通過透鏡時的折射率也不同，這樣物方一個點，在象方則可能形成一個色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察，都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣

色差(Chromaticaberration)P圖示：色差的產生圖示：色差的消除

PP’n1n22.球差(Sphericalaberration)由主軸上某一物點向光學系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經該光學系列折射后，若原光束不同孔徑角的各光線，不能交于主軸上的同一位置，以至在主軸上的理想像平面處，形成一彌散光斑（俗稱模糊圈），則此光學系統(tǒng)的成像誤差稱為球差。

球差造成的結果是，一個點成像后，不在是個亮點，而是一個中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑。

球差(Sphericalaberration)軸上物點發(fā)出的大孔徑光線不聚焦于一點PP

球差的矯正常利用透鏡組合來消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的，可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來給予消除。

3.慧差：

由位于主軸外的某一軸外物點，向光學系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經該光學系列折射后，若在理想像平面處不能結成清晰點，而是結成拖著明亮尾巴的慧星形光斑，則此光學系統(tǒng)的成像誤差稱為慧差?；鄄?Coma)

圖示：慧差的產生靠近光軸的物點發(fā)出的大孔徑光線不聚焦于一點

PXY慧尾形的彌散像圖示：不同大小慧差的照片慧差的校正：

復合透鏡；

加光闌；不暈點---同時消除了球差和慧差的一對共軛點

非球面透鏡；4．像散（Astigmatism）

像散也是影響清晰度的軸外點單色相差。當視場很大時，邊緣上的物點離光軸遠，光束傾斜大，經透鏡后則引起像散。像散使原來的物點在成象后變成兩個分離并且相互垂直的短線，在理想象平面上綜合后，形成一個橢圓形的斑點。像散是通過復雜的透鏡組合來消除。

造成光學系統(tǒng)出現軸上像散的主要原因有兩個一是光學面有較大的偏心，二是光學面變形。消除方法：通過復雜的透鏡組合來消除5．場曲（Curvatureoffield）

場曲又稱“象場彎曲”。當透鏡存在場曲時，整個光束的交點不與理想象點重合，雖然在每個特定點都能得到清晰的象點，但整個象平面則是一個曲面。這樣在鏡檢時不能同時看清整個相面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場物鏡，這種物鏡已經矯正了場曲。

圖示：場曲的產生物平面對應的子午面、弧矢面、最小彌散圓平面為曲面場曲與像散結伴而生6．畸變（Distortion）

前面所說各種相差除場曲外，都影響象的清晰度?；兪橇硪环N性質的相差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響象的清晰度，但使象與原物體比，在形狀上造成失真。畸變(Distortion)物平面 枕形畸變 桶形畸變畸變成像：枕形畸變是由于視場邊緣部分的放大率高于中心部分放大率所引起桶形畸變是由于視場邊緣的放大率比中心部分低所引起的

像差球差象散慧差場曲負畸變正畸變光學顯微鏡基本結構：1.照明燈(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.載物臺和切片夾(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推進器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物鏡(Objectives)6.粗細螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目鏡(Oculars)8.照相機等接口(Connectiontocamera,etc.)數值孔徑N.A（n.sin）數值孔徑的大小代表了光鏡的會聚能力。數值孔徑越高，光鏡的分辨力越大，所呈影像的亮度越強。（一）數值孔徑

數值孔徑簡寫：NA，數值孔徑是決定物鏡性能的非常重要的參數它是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（n）和孔徑角（u）半數的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。它是一個比物鏡的焦距更加實用的特性.任何設計良好的物鏡孔徑將能夠表示:1.在多遠的給定焦距可以看清標本中的細微結構2.當孔徑充滿時可以通過物鏡的光量

孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。

顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值?；谶@一原理，就產生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于一，NA值就能大于一。

以空氣為介質（干燥系）的物鏡的NA值多在0.05-0.95之間?？諝獾恼凵渎蕿閚=1，二孔徑角最大不能超過180度，否則會因為物鏡工作距離等于零而無法工作。Sin(180/2)=1，所以空氣介質的NA值小于1。用高倍顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法進一步增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值?；谶@一原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于1，NA值就能大于1。水的折射率為1.333，水浸系物鏡的NA值最大可達到1.25。香柏油的折射率為1.515左右，因此一般油浸物鏡的數值孔徑最大值（NA值）為1.4，這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前，高級物鏡用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。介質空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66數值孔徑與其他技術參數有著密切的關系，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。

（二）分辨率

顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，又稱“鑒別率”。其計算公式是：分辨率Z=0.61*λ/N.A

式中為Z最小分辨率距離；為λ光線的波長；NA為物鏡的數值徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則值越小，分辨率就越高.提高分辨率的效果要提高分辨率，即減少值，可采取以下措施（1）降低波長λ值，使用短波長光源（2）增加介質值以提高NA值（3）增加孔徑角值以提高NA值（4）增加明暗反差（三）放大率

放大率和有效放大率：由于經過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：Γ=βΓ1顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯系的概念

有關系式：500NA<1000NA當選用的物鏡數值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以放大鏡原理為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

根據：總放大率=物距/物鏡焦距×相距（250mm）/目鏡焦距；增大物距—即鏡筒長度，可以提高放大率，但是鏡筒不能無限拉長，通常國際標準長度為160mm。（四）焦深

焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其它技術參數有以下關系：

1．焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔鏡成反比。

2．焦深大，分辨率降低

（五）鏡像亮度

鏡像亮度是指顯微鏡觀察中的圖像明暗程度。一般鏡檢中，鏡像亮度要求使眼鏡既不感到暗淡，又不耀眼為好。顯微鏡的鏡像亮度與放大倍數有什么關系？物鏡的NA值大，鏡像的亮度越大，總的放大倍數越高。焦點深度（六）視場亮度

視場亮度是指顯微鏡所觀察的整個視場（或視野）明暗程度，視場亮度不僅僅與物鏡，目鏡有關，也與聚光鏡、視場光闌和光源有關。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度增大，鏡像亮度也增大。（七）視場直徑

視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑23最為科學，大視場容易引起場曲。F=FN/M;F:視場直徑，FN：視場數，M:物鏡放大率。視場數（FieldNumber,簡寫為FN），標刻在目鏡的鏡筒外側。由公式可看出：

1．視場直徑與視場數成正比。

2．增大物鏡的倍數，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

不同目鏡的視場直徑(八)蓋玻片校正

由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產生了相差，這就是覆蓋差。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。(九)工作距離工作距離是指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離.工作距離短,物鏡的孔徑角則大.換而言之,數值孔徑大的高倍鏡,其工作距離小.焦點：決定圖像是模糊還是清晰？焦點與焦距有關，且可以通過聚焦旋鈕控制。樣本載波片上的蓋片厚度也會影響圖像對焦??蓋片對物鏡而言可能太厚。正確的蓋片厚度應標注在物鏡的側面?；ǚ哿梗ㄗ髨D）和失焦（右圖）時的顯微鏡圖像分辨率：圖像中的兩個像素達到多近的間距時會分辨不清？分辨率與物鏡的數值孔徑（數值孔徑越大，分辨率越高）以及通過透鏡的光線波長（波長越短，分辨率越好）有關?；ǚ哿５母叻直媛剩ㄗ髨D）和低分辨率（右圖）顯微鏡圖像調節(jié)不同參數產生的效果亮度：表示圖像有多明亮？亮度與照明系統(tǒng)相關，因而可以通過改變燈的電壓/電阻器，以及調節(jié)聚光器和光圈/針孔孔徑進行更改。此外，亮度還與物鏡的數值孔徑有關（數值孔徑越大，圖像越明亮）。花粉粒在高亮度（左圖）和低亮度（右圖）情況下的顯微鏡圖像對比度：樣本周圍區(qū)域的光照差別怎樣？對比度與照明系統(tǒng)相關，可以通過改變光線強度以及光圈/針孔孔徑對其進行調節(jié)。除此之外，對樣本進行化學著色也可以增強對比度?；ǚ哿Ｔ诟邔Ρ榷龋ㄗ螅┖偷蛯Ρ榷龋ㄓ遥┣闆r下的顯微鏡圖像三.顯微鏡的構造

顯微鏡的基本構造包括兩大部分,光學系統(tǒng)和機械系統(tǒng),機械系統(tǒng)有鏡座,鏡柱,鏡壁,鏡筒,物鏡轉換器,載物臺,調焦螺旋,聚光器調節(jié)螺旋.光學系統(tǒng)有物鏡,目鏡,反光鏡,聚光器,虹彩光圈.1.物鏡

齊焦性能和合軸程度齊焦性能是反映某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后,在轉換至另一倍率的物鏡時,其成像亦應基本清晰,而且物鏡光路也基本合軸,中心不偏離.根據物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質不同，可分為：①干燥系物鏡以空氣為介質，常用的40×以下的物鏡，數值孔徑均小于1。②水浸系物鏡③油浸系物鏡根據物鏡放大率的高低，可分為：①低倍物鏡指1×—6×，NA值為0.04—0.15；②中倍物鏡指6×—25×，NA值為0.15—0.40；③高倍物鏡指25×—63×，NA值為0.35—0.95；④油浸物鏡指90×—100×，NA值為1.25—1.40。

物鏡結構根據物鏡像差校正的程度來分類可分為：①消色差物鏡是最常用的物鏡，外殼上標有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和藍光形成的色差。鏡檢時通常與惠更斯目鏡配合使用。②復消色差物鏡物鏡外殼上標有“Apo”字樣，除能校正紅、藍、綠三色光的色差外，還能校正紅、藍色光造成的球差，通常與補償目鏡配合使用。③半復消色差物鏡

④平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達到校正場曲的缺陷，提高視場邊緣成像質量的目的。對于平視場消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補償。而平視場復消色差物鏡，則必須用目鏡來補償它的倍率色差。⑤特種物鏡在上述物鏡基礎上，為達到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無應變物鏡，無罩物鏡，長工作距離物鏡等。

2.目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大了的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結構較物鏡簡單，普通光學顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。

1.惠更斯目鏡眼點教低3mm2.冉姆斯目鏡眼點較高12mm3.凱爾勒目鏡4.補償目鏡不能與數值孔徑低于0.65的物鏡配合使用5.平場目鏡

3.聚光鏡聚光鏡又名聚光器，裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。1.集光器的效用收集光源光線并集合將其成束，以增強照明亮度。通常由2-3個凸透鏡組成，最上面的透鏡面為平面。2.物鏡的有效鏡口率=（物鏡鏡口率+集光器鏡口率）/21、阿貝聚光鏡2、消色差等光程聚光鏡3、搖出式聚光鏡4、極低倍聚光鏡4顯微鏡的照明裝置顯微鏡的照明法按其照明光束的形式，可分為“透射式照明”和“落射式照明”兩大類。透射式照明適用于透明或半透明的被檢物體，絕大多數生物顯微鏡屬于此類照明法；落射式照明則適用于非透明的被檢物體。透射式照明又可分為中心照明和斜射照明兩種形式。中心照明又分為臨界照明法和柯勒照明法。

5.物鏡4.標本平面3.聚光鏡2.聚光透鏡

1.光源

8.二次燈像

7.物鏡

6.標本平面5.聚光鏡4.孔徑光闌3.視場光圈2.聚光透鏡1.光源

臨界照明法柯勒照明法落射式照明1.光源2.聚光透鏡3.孔徑光闌4.視場光圈5.聚光透鏡6.半透膜反射鏡7.物鏡8.被檢物體9.至中間像面光路5顯微鏡的幾種附件1.游標尺游標尺在普通顯微鏡上常標刻在載物臺上的推動器上，研究用顯微鏡多標刻在載物臺的縱橫邊緣。它的主要作用是：１）可粗放測量被檢物的大小或長度；２）提供被檢標本的坐標位置。觀察被檢物體時，如發(fā)現其要點，可將縱、橫座標刻度記錄在案，待以后鏡檢時，只要按所記刻度進行觀察，隨即在視場中被找到。2.顯微測微尺顯微測微尺是用來測量視場中被檢物體的大小、長短的工具。包括有目鏡測微尺和測微臺尺（也稱鏡臺測微尺），用時必須兩者互相配合，才能完成其測量功能。3.投影屏和投影目鏡4.共覽裝置左：目鏡測微尺下：測微臺尺0.01mm

生物光學顯微鏡的種類倒置顯微鏡1倒置顯微鏡的特點1.投射光倒置顯微鏡的光源和聚光器位于載物臺的上方，照明光源自上方向向下照射；2.物鏡安裝在載物臺的下方，向上對焦；3.物鏡、聚光鏡以及其他光學具組均適用于長焦距觀察；4.其一般物鏡最大放大率僅限于40X以內，這是因為在光學設計中，無法同時解決大數值孔徑和長工作距離的要求；5.在醫(yī)學生物學領域中適合觀察培養(yǎng)瓶中貼壁生長的細胞或浮游于培養(yǎng)液中的細胞物鏡補償環(huán)的調節(jié)常常遇到不同厚度的瓶壁影響觀察效果。為了補償這一弊端，倒置顯微鏡的物鏡裝有補償環(huán)。遇到厚度不同瓶壁影響清晰度時，可調節(jié)此環(huán)得到最佳反差時為止。一般具有相差物鏡，用于觀察培養(yǎng)的活細胞。2體視顯微鏡（Stereomicroscope）其光學結構原理是由一個共用的初級物鏡，對物體成像后的兩個光束被兩組中間物鏡亦稱變焦鏡分開，并組成一定的角度稱為體視角（一般為12度--15度），再經各自的目鏡成像，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得，利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角，為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。特點

1．雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角—體視角（一般為12度---15度），因此成像具有三維立體感；2．像是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把像倒轉過來的緣故；3．雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長4．焦深大，便于觀察被檢物體的全層。5．視場直徑大。6.對觀察體無需加工制作，直接放入鏡頭下配合照明即可觀察。觀察物要求放大倍率一般不大，在200倍以下，常用的在4X-45X之間，以落照射明為主，也可用透射光觀察透明物體或半透明物體，或觀察物體的輪廓。因物鏡與觀察體距離較大，可進行鏡下操作。應用于微電子行業(yè)，醫(yī)學外科等部門。3、暗視野顯微鏡應用：微小粒子、細菌形態(tài)、細菌記數，透明標本觀察等。(一)原理和結構特點

在日常生活中，室內飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒粒可見了，這是光學上的丁達爾現象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設計的。丁達爾現象暗視野顯微鏡是在普通光學顯微鏡中去除明視野集光器，換上一個暗視野集光器而成。它的結構特點主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋,不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上。明場普通顯微鏡成像光路圖暗場照明光路圖標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內，因而整個視野是黑暗的。成像特點及優(yōu)缺點在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像,并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結構，只能呈現出物體的輪廓而且比實物要大。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時，可用厚黑紙片制作一個中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。(二)制作中央遮光板

(1)．將顯微鏡聚光器調到最高位置，用低倍鏡對好焦距。

(2)．取下目鏡，從鏡筒中觀察并調節(jié)光闌的大小，使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等。

(3)．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同，中央部分的大小與調節(jié)好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規(guī)量取大小)。

(4)．將中央擋光板放在濾光片框架上，開大光闌進行樣品觀察。如需使用高倍鏡作暗視野觀察，應按高倍鏡對焦后的視野大小重新制作中央擋光板。（三）使用方法(1)．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。

(2)．選用強的光源，但又要防止直射光線進入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。

(3)．在聚光器和標本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。

(4)．升降集光器，將集光鏡的焦點對準被檢物體，即以圓錐光束的頂點照射被檢物。如果聚光器能水平移動并附有中心調節(jié)裝置，則應首先進行中心調節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。

(5)．選用與聚光器相應的物鏡，調節(jié)焦距，找到所需觀察的物像。(6)．觀察并記錄結果。要求與注意事項(1)制作標本時所用的載玻片和蓋玻片均應清潔干凈，必須使用薄玻片(載玻片厚度約1.O～1.1mm，蓋玻片厚度約0.1mm)，否則會影響暗視野集光器斜射光焦點的調節(jié)，如載玻片太厚，焦點只能落在載玻片內，就不能看到物像。標本也不能過厚。(2)采用的光源宜強，一般均用強光燈照明。光線暗則物像不清晰。(3)調節(jié)光源：使光線集中在暗視野集光器上。先用低倍鏡觀察，移動暗視野集光器，使其中央的一個圓圈恰好處在視野的中央。如暗視野集光器已準確固定好，則可免去這一步驟。(4)先在暗視野的集光器上加香柏油一滴，然后將標本放在載物臺上，把暗視野集光器向上移，使其上的柏木油與標本片的底面接觸，中間不能有氣泡存在。暗視野顯微鏡下蒼白密螺旋體4相差顯微鏡原理和結構特點光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。當光波遇到物體時，其波長(顏色)和振幅(亮度)發(fā)生變化，于是就能看到物體，當光波通過透明的物體時，雖然物體的內部不同結構會有厚度和折光率不同的差異，而波長和振幅則仍然是不會發(fā)生改變的。因此，就不易看清這些不同的結構。用普通光學顯微鏡觀察一些活的微生物或其他細胞等透明物體時，也就不易分清其內部的細微結構。但是，光線通過厚度不同的透明物體時，其相位卻會發(fā)生改變，形成相差。不過，相差不表現為明暗和顏色的差異，這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。我們可以利用光學的相干干涉原理，可以把相差改變?yōu)檎穹?，這樣就能使透明的、厚度和性質不均勻的結構表現明暗的不同，能夠較清楚地予以區(qū)別。如果這兩條光波射到光屏的同一點上，而且一條光波比另一條光波遲滯了半個波長，即兩條光波因位相相反而互相干涉抵消則光線消失，或者相對振幅相互影響而光線減弱。如果一條光波雖然遲滯了一個波長,但兩條光波位相相同,則因波的疊加而光線增強-明相差+暗相差相差顯微鏡，能夠通過其復雜的結構，改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現象，把相差變成振幅差，即明暗差，可以被我們的感覺器官所感知。同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。成像光路圖相差顯微鏡的構造特點相差顯微鏡的構造以普通顯微鏡為基礎，與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個調節(jié)合軸用的望遠鏡。相差環(huán)則是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，放置在光源通路上，使光線只能由環(huán)狀部分通過，環(huán)狀光圈的大小可由集光鏡的數值口徑(N.A)來調節(jié)。環(huán)狀光圈的大小由不同大小的環(huán)狀孔控制。環(huán)狀光闌的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相差環(huán)相差物鏡是在物鏡的后焦點處加一環(huán)狀相板。相板由光學玻璃制成，安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，具有改變相位的作用。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。放大倍數不同的物鏡，其相板也不同。調軸望遠鏡：是用來進行合鈾調節(jié)的。使用不同的相差物鏡時，應配合相應的環(huán)狀光圈，并用合軸調節(jié)望遠鏡觀察環(huán)狀光圈和相板，調節(jié)至環(huán)狀光圈的亮環(huán)與相板的暗環(huán)完全重合。這樣，光線通過標本后，就必須經過相板而發(fā)生相位的改變，造成明暗差異的影像。要使得聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。環(huán)狀光圈、相差物鏡配合與調節(jié)好之后，其他操作方法與普通光學顯微鏡相同。使用方法（1）相差裝置的調換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調焦打開光源，旋轉集光器轉盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調焦。旋轉環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40X時應用40X標示孔的光闌。（3）合鈾調整拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動望遠鏡內筒使其上升，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規(guī)要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。用途位相顯微鏡是利用樣品中質點折射率的不同或質點厚度的不等，產生光線的相位差，使新鮮標本不必染色就可以看到，而且能夠觀察到活細胞內線粒體及染色體等精細結構，還可以應用于霉菌、細菌、病毒等更微小活體的研究，進行標本形態(tài)、數量、活動及分裂、繁殖等生物學行為觀察，并可進行量度與比較。

用途：觀察未經染色的玻片標本

相差顯微鏡比普通光鏡多了2個部件：①在聚光器上增加一個環(huán)形光闌；②在物鏡后焦面增加一個相板，相板上有一個環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過的光超前或滯后1／4，這樣就使通過標本不同區(qū)域光波的相位差轉變?yōu)檎穹?。相差顯微鏡具有兩個其他顯微鏡所不具有的功能:①將直射的光(視野中背景光)與經物體衍射的光分開;②將大約一半的波長從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強度的變化。

5熒光顯微鏡(fluorescencemicroscopy)是以紫外線為光源來激發(fā)生物標本中的熒光物質，產生能觀察到各種顏色熒光的一種光學顯微鏡。利用它可研究熒光物質在組織和細胞內的分布。

什么是熒光?物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。熒光（Fluorescence）：

自發(fā)熒光：由細胞本身存在的物質經紫外線照射后發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光：一些細胞成分本身經紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。熒光素(fluorochrome)是指一類可以吸收激發(fā)光的光能，并能發(fā)射熒光的物質．一定的熒光素能和組織（細胞）的某些成分發(fā)生特異結合，并在相應部位呈現一定的顏色的熒光．熒光顯微鏡的基本構造普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質標記細胞中的特定成分或結構，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結構模糊、發(fā)虛，原因是大多數生物學標本是層次區(qū)別的重疊結構）。6激光掃描共聚焦顯微鏡焦點模糊

對于有一定厚度的樣品（大于2微米），一方面，由于在物鏡聚焦平面上下的平面上也有熒光被激發(fā)，焦平面上的熒光圖像將有一定的模糊，這被稱為軸向（Z）干擾；另一方面，感興趣區(qū)域的樣品也會受到同一焦平面上鄰近區(qū)域所激發(fā)的熒光的干擾，使得圖像的對比度降低，這被稱為側向（XY）干擾。LSCM的工作原理

激光掃描共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光器發(fā)出的激光，透過光源針孔形成點光源,激發(fā)光透過激發(fā)波長濾片后到達分光鏡。由于分光鏡能夠反射波長較短的激發(fā)光，而透過波長較長的發(fā)射光，所以激發(fā)光在分光鏡處被反射，透過物鏡，在掃描裝置和控制裝置的控制下在熒光標記標本的焦平面上逐點掃描。熒光標記被激發(fā)出來的發(fā)射光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，透過分光鏡后再通過吸收波長濾片，隨后通過探測針孔到達光電倍增管(PMT)經過信號處理，在計算機顯示屏上形成圖像。

LSCM的主要組成部分照明針孔：使激光經過照明針孔后形成點光源，點光源具有光源方向性強、發(fā)散小、亮度高、高度的空間和時間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨特的優(yōu)點。且與探測器針孔及焦平面形成共聚焦裝置。光束分離器：將樣品激發(fā)熒光與其他非信號光線分開。物鏡焦平面：激光點光源照射物體在焦平面處聚焦，激發(fā)熒光標記的樣本發(fā)射熒光，形成焦點光斑。該光斑經過objective,beamsplitter等一系列裝置的處理，分別在illuminatingpinhole及detectorpinhole兩處聚焦。共聚焦的含義由此而來。探測器針孔：與beamsplitter作用類似，起到空間濾波器的作用。最大限度的阻礙非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦點斑以外的散射光，以保證探測器針孔所接受到的熒光信號全部來自于樣品光斑焦點位置，因此樣品上衍射聚集光斑和探測器針孔成像光斑包含相同信息（兩點共軛）。PMT：光電倍增管（探測器）：接受通過針孔的光信號，轉變?yōu)殡娦盘杺鬏斨劣嬎銠C，在屏幕上出現清晰的整幅焦平面的圖象。激光器：共聚焦顯微鏡技術的發(fā)展離不開激光器的飛速發(fā)展。我們可以根據研究需要選擇不同的激光器。多熒光通道：具有多個熒光通道，以實現同時對樣品進行多種標記。LSCM與熒光顯微鏡不同之處在此過程中,由于激光光源的光源針孔和探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,即所謂的“共聚焦”，樣品焦平面上的點同時聚焦于光柵針孔和探測針孔，即只有焦平面上的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在檢測小孔平面是離焦的不能通過小孔，因此，對樣品進行掃描時，掃描點以外的非觀察點不會成像，背景呈黑色，樣品需經逐點掃描后才形成整個標本的光學切片。激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:1.點照明，激光光源2.具有照明小孔和探測小孔3.照明小孔和探測小孔共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”6.真正的三維重組7.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物第二章光鏡標本基本制作技術

生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類顯微制片技術雖是生物學中很基本的操作技術，但由于生物材料的個體差異，化學試劑的多樣性，因此操作技術相當細致而復雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導致整體的失敗，因此需要耐心細致，不斷總結經驗，才能得到較好的結果。1非切片法

即不用切片機，不經切片手續(xù)而制成切片的方法，根據材料性質的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結構不被破壞，涂片法，壓片法彌補了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標本制備的中常用的手段。非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、離析法等1涂片法主要用于血液、尿液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細胞，再經固定，脫水，染色等手段制成永久標本。2鋪片法主要用于動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。如:洋蔥表皮細胞的鋪片制備。

3壓片法一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。4離析法該方法是利用化學試劑使組織的細胞間質溶解，使細胞能分散成單個個體。經染色，脫水，透明即可觀察其個體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。5磨片用于很堅硬的組織，如骨和牙。2切片法

切片法是必須依靠手或切片機將組織切成薄片來進行觀察的方法，根據所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標本。

2.1取材根據不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。一般組織學取材稍大，細胞學取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。

2.1.1動物的麻醉和殺死

從活的動物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因為在不施加麻醉的情況下，有的動物會收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會騷動(如蛙、鼠)，使我們無法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細胞學方面的研究對材料的新鮮程度要求更嚴。因此，要割取生活著的動物組織，在一般情況下，就要對動物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細胞結構為原則。

若是一般的組織學制片，要求不太嚴格的話則可將動物先殺死然后速取其組織進行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。取材注意事項1材料保持新鮮2組織塊免受擠壓3組織塊力求小而薄4盡量保持組織原有形態(tài)5選取好組織塊切面6選擇動物品種和熟悉取材的解剖部位7切除不需要的部分8保持材料的清潔

2.2固定割取組織塊后，應立即進行固定。固定是制片極為關鍵的一個步驟，制片質量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關外，還取決于最初的固定是否適當和完全。

2.2.1固定的意義

新鮮的組織被割取后,由于細胞內酶的作用和細菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應立即采用一種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結構，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定的目的和作用在于：①使細胞內的蛋白質、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來,防止組織自溶和腐敗,從而保存細胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結構；②因沉淀及凝固的關系，使細胞內不同的成分產生不同的折光率，造成光學上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結構變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細胞各部易于染色；③固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化不易變形，有利操作。

2.2.2固定的方法

固定有物理方法和化學方法兩種。物理方法固定有干燥、高熱和低溫驟冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學反應的制片是以低溫驟冷固定作冰凍切片的?；瘜W方法固定就是用化學試劑配制成固定液使之固定。

固定注意事項及影響因素1固定組織塊不宜過大,以便固定液迅速滲透2軟組織或較大塊的組織可先經2-3小時的固定,然后修整成小塊再重新投入新配制的固定液中繼續(xù)固定3固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜4固定時間的長短視固定劑的種類,氣溫,組織塊的大小而定

2.2.3固定液的選擇固定液的種類很多?？煞譃閮纱箢悾汉唵喂潭ㄒ汉突旌瞎潭ㄒ?。簡單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對細胞的某種成分固定得較好；不能將細胞所有的成分都保存下來。混合固定液就是用幾種化學藥品，按一定的比例混合配制而成，由于各種藥品的優(yōu)缺點互相彌補，因此可產生較好的效果。（3）按固定的方式將固定液分為兩類：凝結型固定液：使蛋白質凝固，形成懸浮顆粒網狀混合液。非凝結型固定液：不使蛋白質凝固，形成透明的凝膠。Ⅰ凝結型固定液：a酒精(alcohol)：70%-75%酒精滲透力最強。特點：①穿透速度快。②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前兩者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以經乙醇固定的標本對核的染色不良，不適于對染色體的固定。③濃度50%以上的酒精可溶解脂肪和類脂體。不能用于膜結構的研究，溶解血色素，破壞其他多種色素。④使糖原沉淀，但能溶于水。⑤是還原劑，在混合固定液中，酒精不能與氧化固定液混用。如鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等。⑥使材料硬化、組織收縮明顯。固定材料適宜濃度為70%-100%。不需沖洗，70%的酒精可較長時間保存，若長期保存材料與甘油等量混合后使用。b醋酸（aceticacid）特點：①穿透力速度極快。②能固定核蛋白，對胞質也存在固定作用。對核蛋白是凝結型固定液，對胞質是非凝結型固定液。使染色質和染色體的固定和染色均很好，因此所有固定染色體的固定液中幾乎都有醋酸。③對脂類和糖類無固定作用。④對材料不但不硬化還有軟化作用。對細胞無收縮作用，稍有膨脹作用。⑤不需沖洗，可投入70%的酒精中保存。固定材料適宜濃度為0.3%-5%。C鉻酸（chromicacid）特點：①穿透速度緩慢。②能沉淀所有蛋白質，凝固核酸，增強核的著色能力，能固定高爾基體及線粒體。常用于細胞學觀察。③對脂類無影響；固定糖原，使之不溶于水。④氧化劑，不能與酒精混用。必須用流水沖洗，直至組織中不含鉻酸為止，如沖洗不干凈或直接投入酒精中，被還原成綠色的氧化鉻并發(fā)生沉淀，使染色困難。⑤使組織硬化，細胞收縮。⑥鉻酸常配成2%或10%的水溶液作為儲備液，固定適宜濃度為0.5%-1%。d苦味酸三硝基苯酚，不能結晶保存，要以飽和溶液存放。干燥時易爆炸。特點：①穿透速度中等。②可沉淀一切蛋白質。對脂類無影響，對糖類無固定作用。③細胞收縮明顯，材料硬化程度很小。④不需沖洗，可直接投入70%酒精中洗去黃色。⑤固定材料適宜濃度為飽和溶液，即0.9%-1.2%。Ⅱ非凝結型固定液：（質量較好）A鋨酸（OsO4）特點：a穿透速度很慢。材料要切的小一些，約1mm3。b不沉淀蛋白質，能使蛋白質被均勻固定，所以用鋨酸固定的蛋白質能保持生活時的均勻性。c是脂肪和類脂類的很好的固定劑

。d強氧化劑，易揮發(fā)，毒性大。e不使細胞收縮，對細胞質固定好。固定物組織柔軟。f流水沖洗12～24小時。使其完全洗凈，否則遇乙醇就發(fā)生沉淀。g固定材料適宜濃度為0.5-2%。B甲醛：（不用于電鏡制片）特點：a穿透速度快。b可與蛋白質化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和類脂類化合物。c還原劑，不能與氧化劑混用。d組織硬化程度顯著，收縮小，但經酒精脫水后，收縮顯著。e不需水洗，可直接投入70%的酒精。但經長期固定的材料，需經流水沖洗1-2天，否則影響染色。f市售的為37-40%甲醛，稱為福爾馬林，固定和保存材料的適宜濃度是10%福爾馬林。

Ⅲ混合固定液：A卡諾(Carnoy)氏固定液：配方：酒精：冰醋酸:氯仿=6:1:3此液適于固定一般動物組織和肝糖原以及植物組織。（多用于細胞學研究）穿透速度快，為防止組織硬化，固定時間不要超過24小時。時間以材料的不同而有所區(qū)別，根尖15min,花藥1小時,糖原在3-5℃下固定,小白鼠睪丸30-50min。固定后可轉入70%中保存，可直接經95%酒精，純酒精脫水。Bouin液配方：飽和苦味酸水溶液:37％－40％甲醛液:冰醋酸＝15:5:1其中冰醋酸能固定染色質,苦味酸能使組織適當硬化,甲醛液可調節(jié)另兩種試劑對組織的膨脹作用.因此,此混合液對組織收縮或膨脹的作用較小,并滲透力強,固定均勻,適合絕大多數器官及組織的固定,能顯示出組織的細微結構,而且染色效果良好,尤其是細胞核的著色.

Zenker固定液：配方:升汞5.0g

重鉻酸鉀2.5g

蒸餾水(加至)100ml臨用前加入冰醋酸.經此液固定的標本，細胞核和細胞質染色頗為清晰，但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學變化而失效。

(4)固定時應注意的問題：①固定的材料越新鮮越好，立即固定。②材料與固定液比例一般為1：20。③根據材料的性質和制片的目的選擇固定液。④有時要用蔗糖、氯化鈉來調節(jié)滲透壓。⑤材料外表有毛或其他不易穿透的物質存在，可先在含酒精的固定液中固定幾分鐘，再換用含水的固定液。⑥含有氣體的材料投入固定液后，不下沉，須將氣體抽出。方法可采用真空泵，或用注射器的簡易方法。⑦材料固定后一定要做標記。3.沖洗：(1)目的：所謂洗滌，即用洗滌劑滲透到材料中，把固定劑洗掉，洗滌必須徹底，才能進行下一步操作。否則留在組織中的固定液有的防礙染色，有的會發(fā)生沉淀物或結晶而影響觀察，有的可以繼續(xù)發(fā)生作用，破壞材料或影響以后的處理。(2)洗滌的原則與方法：常用的洗滌劑是水和低濃度的乙醇。①固定液用水配的，就用水或流水來沖洗；不需流水沖洗的材料，放在小瓶內，換數次水，每次1-2小時。②用各種濃度的酒精配的，就要用與固定液相近濃度的酒精沖洗；材料：酒精=1：10。③用福爾馬林固定的不用水洗，但長期固定的，應充分水洗，否則影響染色。④用鉻酸、重鉻酸鉀等固定的材料就用流水沖洗。沖洗時間應和固定時間相同或再長。

4.脫水：

就是用一種溶劑把材料中的水份全部代替干凈。(1)脫水原因：在制作永久制片時，組織沖洗完畢后必須進行脫水，因組織固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蠟包埋劑混合，組織內只要有極少量水份，就會防礙包埋劑的滲入。(2)脫水的結果：使材料變硬，形狀更加穩(wěn)定，利于組織永久保存。除盡材料的水份，才能使透明劑、包埋劑、封藏劑滲透到組織中，有利于組織的透明和浸蠟。(3)脫水劑應具備的兩個特性：①必須是親水性，能與水以任何比例混合，代替細胞中的水份。②必須能和其他有機溶劑混溶取代。

(4)脫水的方法：脫水應逐步進行，而不能驟然進行，否則會引起組織的強烈收縮，或使材料變形。一般把脫水劑配成各種濃度，材料自低濃度到高濃度依次經各級脫水劑，其中所含水份逐漸被脫水劑取代。(5)脫水劑分為兩類：

①非石蠟溶劑的脫水劑：如乙醇、丙酮等，組織脫水后必須經二甲苯透明才可浸蠟。②石蠟溶劑的脫水劑：如正丁醇等，組織脫水后即可直接浸蠟，不需經過中間溶劑二甲苯之類的藥品。(6)常用的脫水劑：乙醇：按濃度梯度依次進行35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%；在各級停留的時間根據材料而定，體積為2mm3的一般每級為1-4小時；在低濃度酒精中，每級停留的時間不易過長，否則易使組織變軟，助長材料解體。從95%到100%乙醇后，時間不能太長，否則材料變硬變脆，影響切片。為使乙醇脫水徹底，應更換兩次100%乙醇。如需過夜應停留在70%酒精中。脫水時的注意事項：a脫水必須要在有瓶蓋內進行，尤其是高濃度乙醇很容易吸收空氣中的水份。b組織由低濃度向高濃度的乙醇轉移時，要用吸水紙吸干余液，以免將水份帶入。C組織脫水要徹底.純乙醇中如有水，可加無水硫酸銅以吸去水份。注：在每級中停留的時間，依照材料的大小、性質以及留在固定液中的時間長短和固定液的溶解性而定。5.透明：材料經脫水劑去水分后，還要經過一種既能與脫水劑，又能與包埋劑相混合的溶劑—透明劑來處理，以便于包埋劑的滲入或封藏。在制片過程中有兩次透明：第一次是組織塊的透明，為了引入包埋劑；第二次是染色以后切片的透明，為了引入封藏劑。常用透明劑：透明劑都是石蠟的溶劑，絕大多數不能與水混合，最常用的透明劑有二甲苯,苯a二甲苯：目前應用最廣。易溶于乙醇，又能夠溶解石蠟，加拿大樹膠，透明力強，作用較快。其最大缺點是容易變硬變脆，材料必須脫盡水分再透明，否則發(fā)生乳狀渾濁。在材料進入二甲苯前，為了減少材料收縮，材料須經過1/2二甲苯+1/2無水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蠟→純石蠟材料在二甲苯中時間不宜過長，否則材料收縮變硬、變脆。一般組織塊透明總時間3-4小時（每級60-120分鐘），染色后的切片透明每級5-10分鐘。

6.浸蠟與包埋：

組織經過透明后要讓石蠟支持劑透入細胞內部使它變硬，并將組織包埋進去，把軟組織變?yōu)檫m當硬度的蠟塊，以便切成薄片。以利于切片和觀察，這個過程稱為“浸蠟”和“包埋”。

(1)石蠟的熔點多為50-60℃。選用不同熔點的石蠟的原則：①石蠟硬度與組織硬度相近似，組織較硬時，用硬的石蠟，反之用軟的石蠟。一般動物材料石蠟的熔點為52-56℃，植物材料石蠟的熔點為54-58℃。②切片較薄時（4um以下），石蠟的熔點為58-60℃。③最重要的要看室內溫度，通常在夏天用熔點高的石蠟（硬蠟），冬天用熔點低的石蠟（軟蠟）。石蠟太硬，切片時容易破碎，不易切成蠟帶，太軟時，蠟帶容易皺縮。

(2)浸蠟：

材料經透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入60℃的石蠟，使石蠟：二甲苯=3：2；放在35-37℃的恒溫箱中浸蠟1-2天。后將溫箱升至60℃，將石蠟和二甲苯倒出，換純石蠟兩次，每次40分鐘至1小時。在

60℃溫箱中最多放5-6小時。動物材料在透明劑與石蠟等量混合液中15-30分鐘，再換純石蠟兩次，每次1-1.5小時。浸蠟注意事項

1盡量保持在較低的溫度中,以石蠟不凝固為度2力求在最短限度時間內完成石蠟透入的過程.溫度過高,或時間過長都會引起組織變硬,變脆,收縮等,影響結果3浸蠟用的石蠟要定期更換,以保持純度（3）包埋：

組織被石蠟透入達到飽和的程度后,就需要進行包埋.所謂包埋就是被石蠟浸透的組織連同熔化的石蠟,一起倒入一定形的容器內(如紙盒)內,并立即投入冷水中,使它立即凝固成蠟塊的過程.

步驟：紙盒放于燙板上，將石蠟和材料一起倒出，用加溫后的解剖針將材料調到合適的位置，標簽有文字的一面向下。再補足石蠟。輕輕提起紙盒的兩側的把手，慢慢平放于盆的水面上，待紙盒內石蠟表面已凝固，即可將紙盒向一側傾斜，使其立即進入冷水中，迅速凝固，經30min-1h后，取出晾干。包埋中出現的問題及解決辦法問題:包埋后的石蠟塊應為均勻的半透明狀態(tài),但是有時候出現白色渾濁的結晶部分,這樣在切片時就有妨礙原因:1脫水不干凈2組織內部或石蠟中混有透明劑3石蠟本身品質不良4組織塊倒如紙盒時,周圍的石蠟已成凝固狀態(tài)5石蠟冷凝得太慢7.切片：

石蠟切片，用旋轉切片機。一個旋轉切片機，可分三個部分，一個是安裝切片刀的部分，有調節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個是安裝材料的部分，也有螺旋可以調節(jié)材料的位置。另一個是操縱在旋轉中向前推進的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復雜的部分。8.貼片：貼附牢固，在染色時不易脫落；使皺褶的蠟片伸展平整。用具：載玻片、粘片劑、解剖刀、蒸餾水、展片機及銬片機。A將展片機溫度調整到42℃，保持恒定。B在載玻片上涂蛋白甘油等粘片劑。C將涂粘片劑的載玻片放在展片機上，滴加蒸餾水數滴，此時若發(fā)現水不均勻分散而聚成滴狀，即表示玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面。D用解剖刀將蠟帶切成小段，每段的長度應以蓋玻片的長度為準，一般應比蓋玻片短約1/5-2/5。分片應從蠟帶交界處分。F將蠟帶輕輕移到涂有水的載玻片上，蠟片光面應向下貼在載玻片上，依次排列整齊。留出右端貼標簽處。G材料展平后，從展片機上取下，稍稍傾斜留出多余的水分，用吸水紙吸干背面及周圍多余水分，放于烤片機（42℃）上烤干水分。切片的方法主要有（ABCD）A石蠟切片法B冰凍切片法C塑料包埋切片法D半超薄切片法E整體封藏法F分離法

石蠟切片術中用于固定的組織塊大小一般為(

C

)

A.1.0mm左右

B.1.0cm左右

C.5.0mm左右

D.5.0cm左右在病理組織制片過程中,取材的要求一般為：(ABCE)A.一般厚度0.2-0.3cm

B.大小0.2~0.3×1.5×1.5cmC.免疫組化染色用組織以1×1×0.2cm為好D.冰凍切片組織塊可厚至0.3-0.4cmE.特殊需要也可大于以上大小組織固定的意義是（）A.使蛋白質迅速溶解B.防止細胞自溶C.使組織膨脹D.使組織堅硬E.防止組織腐組織固定時所使用的固定液的量一般為()A2倍B4倍C8倍D10-15倍下列物質那些能固定蛋白質（）A乙醇B苦味酸C醋酸D鉻酸E重鉻酸鉀F福爾馬林即能固定白蛋白又能固定核蛋白的物質是（）A乙醇B醋酸C福爾馬林D鉻酸E苦味酸 F重鉻酸鉀固定高爾基體和線粒體的固定劑可選（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸E重鉻酸鉀固定劑乙醇可以與那些物質混合使用（）A福爾馬林B醋酸C鉻酸D鋨酸E升汞固定速度最慢的物質是（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸固定后不會發(fā)生組織收縮的物質有（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸E重鉻酸鉀F鉻酸甲醛屬于常用的單純組織固定液，對其描述下面錯誤的是()A．相對而言，甲醛水溶液滲透能力強組織固定均勻B．甲醛價格較低，可用于固定和保存大體標本C．長時間固定的標本，形成的甲醛色素沉積無法去除，故而組織固定不能時間過長D．長時間固定的標本，形成甲醛色素沉積可用乙醇配氨水去除E．甲醛固定能保持脂類和類脂類對于重鉻酸鉀固定劑，對其描述下面錯誤的是A．重鉻酸鉀為橙紅色晶體，有毒B．用于固定高爾基體和線粒體效果較好C．組織穿透速度快D．重鉻酸鉀固定的組織明顯收縮E．重鉻酸鉀固定的組織，酸性染料著色良好那些固定劑固定后需要用水清洗（）A福爾馬林B醋酸C苦味酸D重鉻酸鉀Ecarnoy液F鉻酸G升汞對于組織固定后的脫水，下面的描述不正確的是()A．脫水是借某些溶媒置換組織內水分的過程B．脫水劑必須能與水以任意比例混合C．根據固定劑的要求選擇脫水劑D．根據被固定組織的要求選擇脫水劑E．乙醇是最常用的脫水劑屬于非石蠟溶劑的脫水劑（）屬于石蠟溶劑的脫水劑（）A乙醇B丙酮C叔丁醇D正丁醇F環(huán)己酮組織脫水后不需要透明直接浸蠟的脫水劑有（）A乙醇B丙酮C正丁醇D叔丁醇關于透明劑二甲苯的敘述正確的是（）A材料在二甲苯中停留過久，容易使材料收縮而變硬變脆B在封片前使用，不易使已染色的切片褪色C通常不直接移入二甲苯中，而是其間經過幾個級度D對脫水不凈的切片，二甲苯不易進入材料，故石蠟也不能透入，切片后將在蠟片上出現空洞不能用于已染色后的切片的透明的是（）A甲苯B二甲苯C苯D氯仿選用不同熔點的石蠟的原則：A石蠟硬度與組織硬度相近似，組織較硬時，用硬的石蠟，反之用軟的石蠟。。B切片較薄時（4um以下），石蠟的熔點為58-60℃.C通常在夏天用熔點高的石蠟-硬蠟，冬天用熔點低的石蠟-軟蠟。D浸蠟用石蠟的熔點應該低于包埋用石蠟的熔點，這樣石蠟才容易透入。E石蠟浸蠟和包埋切極薄的片子時,將2-3種不同熔點的石蠟混合使用，可得到較好的效果。包埋后的石蠟塊出現白色渾濁的石蠟結晶，原因是（）A材料脫水不充分B材料或石蠟中混有透明劑C包埋時動作太慢，組織塊進入包埋框時框內四周的石蠟已成凝固狀態(tài)D石蠟凝固太慢也會產生結晶。E石蠟本身品質不良關于石蠟包埋敘述正確的是（）A注意溫度的控制，包埋時溫度太高，石蠟凝固太慢，會在蠟塊中出現氣泡B如果將蠟塊突然放入水中，蠟塊會產生破裂；C溫度過低時材料與其周圍的石蠟不能凝固得緊密，也不易趕走氣泡，而不能切片。D夏季采用熔點較高的石蠟,冬季宜選用熔點較低的石蠟

切片染色后封片常用中性樹膠（加拿大樹膠）主要是因為：()A.樹膠與玻璃的折射率不相等B.樹膠與玻璃的折射率幾乎相等C.樹膠的折射率比玻璃大D.樹膠的折射率比玻璃小E.樹膠的折射率為1組織切片常見問題與對策圖1、2蠟塊的上下兩邊與刀片的水平線不平行圖4蠟塊粗修時沒有完全修全,組織沒有充分暴露最大面就急于裱片,切片上形成許多不規(guī)則的空洞圖6當切蠟塊用的力太猛太重時,組織中的小斑點、小斑塊從蠟塊中脫落,在切片上留下一個個小空洞圖單張切片,用鑷子沿蠟塊的底端平行牽拉,可形成蠟帶圖12、13切片跳片或厚薄不均圖15刀刃有缺口,造成切片有裂隙圖16、17組織內有異物,造成切片有粗細不等的劃痕圖18切片刀上有碎組織廢屑或碎蠟屑等異物,造成切片上有輕微的劃痕圖26皮膚切片邊緣折疊圖27子宮肌瘤組織切片在漂烘儀水面沒有完全展開形成皺折圖28切片在漂烘儀水面沒有完全展平,與載玻片帖附不牢固,形成波浪狀起伏,顯微鏡下難以聚圖22組織切片在漂烘儀展片時形成的氣泡,經烘/烤片后染色時氣泡破裂,造成破裂區(qū)域染色深染9.染料與染色：[1]染色劑的性質：具備兩個性質，一要具有顏色，二要與被染組織間有親和力。

如果只有顏色而與被染物體之間無親和力，那只能是顏料或合色