課題-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

PCR原理

細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分

與反應(yīng)條件

DNA復(fù)制的知識(shí)解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

思考：體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？

DNA的合成方向DNA雙鏈的方向，區(qū)分DNA的3′端和5′端DNA復(fù)制方向示意圖DNA變性和復(fù)性示意圖TaqDNA聚合酶的應(yīng)用DNA聚合酶的特性，只能從DNA的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈、而不能從頭合成DNA高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活課題2“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”Taq細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過(guò)程PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：

1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；

2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；

3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。PCR的反應(yīng)過(guò)程一般采用變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)。

⑴變性：將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到95℃，使雙螺旋DNA解開(kāi)成為單鏈。⑵復(fù)性：通過(guò)降低反應(yīng)溫度至55℃，使兩種引物能與兩條解開(kāi)的DNA互補(bǔ)鏈的3`端粘合。⑶延伸：將反應(yīng)溫度提高到約72℃，在耐熱DNA聚合酶的催化下，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增一倍。按照上述步驟重復(fù)操作約30次，即可將模板DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。三、實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10分鐘將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)注意事項(xiàng)：詳見(jiàn)操作提示

四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測(cè)定：稀釋→對(duì)照調(diào)零→測(cè)定→計(jì)算（公式見(jiàn)P63）波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)照50倍練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡(jiǎn)單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是A