定量PCR原理及實驗方法

定量PCR原理及實驗方法方法簡介所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。RT-qPCR是由三個步驟組成：反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;檢測:實時檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(Keyporint):分析結(jié)果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測方法設(shè)計反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非標(biāo)準(zhǔn)化影響試驗的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結(jié)果中會得到混淆的錯誤結(jié)果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進(jìn)行質(zhì)量評價以達(dá)到最小化變異性，最大化可重復(fù)性，而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對基因表達(dá)分析的標(biāo)準(zhǔn)化的需要是與人類臨床診斷分析相適應(yīng)的。存在的問題由于各個學(xué)術(shù)團(tuán)體和科研機(jī)構(gòu)使用不同的操作流程，必然導(dǎo)致大家使用不同定量的來源物以及數(shù)據(jù)分析：新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細(xì)胞，組培細(xì)胞總RNA或者mRNARNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的不同的引發(fā)策略不同的酶以及酶的不同組合變異系數(shù)、靈敏度多類型的檢測化學(xué)方法，反應(yīng)的條件，熱循環(huán)儀的分析以及匯報方式。每一步驟缺乏標(biāo)準(zhǔn)化分析流程造成了在樣品的處理，內(nèi)參的使用，歸一化的方法，質(zhì)量控制等等因素嚴(yán)重影響RT-qPCR的可信度，重復(fù)性。RNA質(zhì)量評價現(xiàn)在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比較了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion來定量同樣的樣品。結(jié)果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數(shù)據(jù)。所以用不同的方法進(jìn)行定量是不明智的。因此，我們需要用統(tǒng)一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。RNA質(zhì)量RNA質(zhì)量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染）以及完整性。傳統(tǒng)的RNA質(zhì)量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流體毛細(xì)電泳系統(tǒng)也是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析RNA質(zhì)量的方法，它通過分析18S以及28SrRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應(yīng)RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數(shù)（RIN）來反應(yīng)。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100%準(zhǔn)確定反應(yīng)mRNA的完整性，因為他們只是反應(yīng)rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。我們使用oligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設(shè)計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。探針設(shè)計的位點分別位于3’5’以及中部。擴(kuò)增產(chǎn)物的之間的比值反應(yīng)RNA的完整性。如果3’5’的比值在1,反應(yīng)較高度完整性，如果高于5說明降解。QRT-PCR抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴(yán)重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學(xué)反應(yīng)，高度的抑制還導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG.是否有抑制物的評價體系：通過對目的樣品進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增效率的檢測通過內(nèi)部擴(kuò)增對照來反應(yīng)樣品處理過程中樣本的情況用細(xì)菌檢測臨床樣品的抑制通過標(biāo)準(zhǔn)人工合成的擴(kuò)增進(jìn)行RT-PCR來反應(yīng)目標(biāo)檢測物的抑制情況反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)RT和PCR單一酶系統(tǒng)RT和PCR分離的酶系統(tǒng)RNA逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇引物主要有三種：隨機(jī)引物：隨機(jī)引物，特別是6nt引物對所有的靶位點不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的結(jié)果，建議使用15nt的隨機(jī)引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA.而且對于一些特殊的變異體以及較長的3’UTR的區(qū)域比較困難特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有：引物的濃度建議使用SYBRGreenI和EvaGreen進(jìn)行擴(kuò)增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程：靶的選擇和試驗設(shè)計針對目的基因序列選擇合適的擴(kuò)增片斷查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴(kuò)增引物,探針以及反應(yīng)條件.RTPrimerDB(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),PrimerBank(/primerbank/index.html)RealTimePCRPrimerSets()如果沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考,以下的設(shè)計方案僅供參考：最廣泛使用的商業(yè)化的軟件BeaconDesigner()DIY的軟件PrimerExpress如果BeaconDesigner無法得到您說需要的結(jié)果，或者獲得到設(shè)計方案的備選數(shù)目不夠的話，可以選擇Sigma-Genosys)的服務(wù)方案，詳細(xì)周到一個免費(fèi)的基于網(wǎng)頁構(gòu)架的引物和探針設(shè)計程序：/products/probe_design.asp您可以挑選其中的4-6對引物進(jìn)行試驗,選擇引物的擴(kuò)增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網(wǎng)站進(jìn)行比對,并且用NCBI的ePCR進(jìn)行虛擬的電子PCR引物設(shè)計簡介DNA引物長度:15-25個堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合，可以考慮用LNA替換幾個堿基，較少引物的長度以及避免引物次級結(jié)構(gòu)和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭?，分之內(nèi)雜交，倒轉(zhuǎn)重復(fù)等等會引起引物的引發(fā)探針對結(jié)合效率達(dá)降低，因此我們選擇引物二聚體的AG為負(fù)值，即:<10kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.引物探針的保存一般遵循以下原則：正向和反向引物保存在-20度，濃度為10mM或者10x工作濃度.探針應(yīng)該避光保存，貯存在-70度，最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。輸入靶序列，用BLASTn在/blast進(jìn)行比對檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進(jìn)行引物和探針設(shè)計在靶序列中避免直接待重復(fù)區(qū)，在重復(fù)區(qū)進(jìn)行雜交容易使得引物非獲得產(chǎn)物性結(jié)合，降低DNA的擴(kuò)增效率以及減少分析的靈敏度?？紤]到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學(xué)分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設(shè)計跨最長內(nèi)含子區(qū)，這樣減少了擴(kuò)增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當(dāng)用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟(jì)的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設(shè)計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。在RT步驟時，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi)!具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，那些區(qū)域探針和引物結(jié)合效率較低盡可能用60-150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，GC含量在60%或者稍小來確定高效的變性，更高度反應(yīng)效率。GC含量高度序列容易產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，短序列擴(kuò)增是的擴(kuò)增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴(kuò)增多標(biāo)準(zhǔn)曲線。用oligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄最好設(shè)計擴(kuò)增子位于靠近模板的3’區(qū)域量PCR除可以對樣品的初始濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量外，還有其它多種豐富的應(yīng)用。還包括基因表達(dá)調(diào)控情況的分析、等位基因的分析等，那么這些功能是如何在一臺定量PCR儀上實現(xiàn)的呢？下面將進(jìn)行一一介紹。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的初始濃度進(jìn)行定量：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知樣品定量，首先要有一組穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴(kuò)增片段長的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必需保證穩(wěn)定。一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個點，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的準(zhǔn)確性。一般一個點重復(fù)三至五次，對于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。以Rotor-Gene3000的操作為例，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品定量是默認(rèn)的分析方法。軟件可在反應(yīng)尚在進(jìn)行時就對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果隨著反應(yīng)的進(jìn)行可實時更新，當(dāng)然也可以等反應(yīng)完全結(jié)束后再進(jìn)行分析。點示“Analysis”，彈出分析框，默認(rèn)分析功能即為“Quantitation”，點擊“Show”，軟件即自動給出包括標(biāo)準(zhǔn)曲線（包括R值，R平方值，擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)曲線公式等）、標(biāo)準(zhǔn)化的熒光曲線、各樣品計算濃度（包括標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等）在內(nèi)的結(jié)果。若是使用SYBRGreenI法，還可進(jìn)行熔解曲線分析，以判斷退火溫度是否合適，產(chǎn)物中是否有引物二聚體的影響。對于SYBRGreenI的客戶，我們建議一定要在最后做一步熔解曲線的分析，這對于反應(yīng)條件的優(yōu)化和結(jié)果的正確判定都有著非常重要的作用。同樣，點擊“Analysis”，在分析窗口中選擇“Melt”，點擊“Show”，自動給出分析結(jié)果。完成了所需的分析之后，如還需給出分析結(jié)果報告，點擊“Analysis”邊上的“Report”選項，選擇報告模板，軟件自動給出報告。利用定量技術(shù)進(jìn)行基因型分析研究：常用的分析方法有兩種，一種是Taqman探針法，一種為FRET探針法（又稱Hyb探針），運(yùn)用以上兩種方法進(jìn)行基因型的分析需要一臺有多通道的熒光定量PCR儀。Taqman探針分析基因型是以擴(kuò)增信號的有無來判定，而FRET探針則根據(jù)擴(kuò)增后片段熔解溫度的不同來判定。以下為用Taqman探針判斷基因型的實例：這里，突變型的探針以FAM熒光素標(biāo)記，野生型的探針以VIC熒光素標(biāo)記，檢測時分別同時檢測了FAM通道和VIC通道的熒光情況。這里，3、4號樣品只在FAM通道有信號，而在VIC通道里無信號，表明這兩個樣品為突變型；1、2號樣品在FAM通道無信號，在VIC通道有信號，表明這兩個樣品為野生型；而5、6號樣品在兩個通道都有信號，但熒光強(qiáng)度恰為其它樣品的一半，說明這兩個樣品為雜合型。并且，我們可以在軟件里將不同的通道定義為不同的基因型，軟件會根據(jù)不同樣品在各個通道的熒光情況，自動對各個樣品的基因型做出判定。以下為用FRET方法分析基因型的實例：如上圖，熒光探針與突變型完全匹配，而與野生型存在一個堿基的錯配，因而打開這兩組雙鏈所需的能量就不同，具體體現(xiàn)在熔解溫度的差異上，因而突變型的樣本有較高的熔解溫度，而野生型的樣品熔解溫度相對較低。在圖中，5號樣本熔解溫度較低，為野生型；2號樣本熔解溫度較高，為突變型；而1、3、4號樣品在高溫和低溫處都出現(xiàn)了熔解峰，則它們?yōu)殡s合型。并且用戶還可以將不同的峰定義為不同的基因型，軟件可根據(jù)用戶的定義自動給出未知樣品的基因型。如上圖表格中所示。利用相對定量的方法分析目的基因的上下調(diào)情況：基因表達(dá)調(diào)控研究中，常用的相對定量方法主要有兩種，Delta-deltaCt法和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法。由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。我們分別來看看以上兩種相對定量分析方法的特點和應(yīng)用。Delta-deltaCt：公式：由Delta-deltaCt的公式可以看出，該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認(rèn)兩個基因擴(kuò)增效率一致。ComparativeDelta-deltaCt法的特點、注意事項及實際應(yīng)用：ComparativeDelta-deltaCt法的一大特點是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。每次實驗都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實擴(kuò)增情況的反映，因此實驗條件需要嚴(yán)格優(yōu)化，并且總會存一定的偏差。用ComparativeDelta-deltaCt法展開定量實驗前，在預(yù)實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene的軟件會自動給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴(kuò)增效率已非常接近，那么后續(xù)實驗中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進(jìn)行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。下面是某科研用戶用Delta-deltaCt進(jìn)行相對定量分析的實例：首先，該客戶分別做了目的基因和看家基因的確標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)軟件自動給出的M值判斷該方法的可行性：如下圖，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，分別對目的基因(GeneofInterest)和看家基因(HousekeeperGene)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并給出相應(yīng)的參數(shù)。從上圖可知，兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的M值分別為-3.525和-3.467，兩者的差值＜0.1，因此，這組看家基因和目的基因可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對定量。確定這兩個基因可以用Delta-deltaCt法分析后，用戶擴(kuò)增了其待測樣品的目的基因和看家基因。經(jīng)軟件自動分析后，給出分析結(jié)果，如下：我們看到，在該客戶的實驗中，以樣品A為對照組，軟件自動組出了樣品B和C的目的基因相對于樣品A的表達(dá)情況。這種方法對于樣品量大，但研究的基因數(shù)目相對較少的客戶特別有用，因為一旦條件優(yōu)化好之后就無需再做標(biāo)準(zhǔn)曲線，節(jié)約了試劑和樣品量，實驗操作也相對簡單。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效率。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點、注意事項及實際應(yīng)用：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對定量分析的最大特點是，應(yīng)用簡便，無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進(jìn)行嚴(yán)格的優(yōu)化。其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。并且，如果用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不同于樣品，比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率并不能真實地反映樣品的擴(kuò)增情況，因此以