生物化學(xué)-生化實(shí)驗(yàn)

“設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)目申請(qǐng)項(xiàng)目名 蘆薈中SOD的分離提項(xiàng)目樸哲 3412020填表日 國(guó)家級(jí)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范填表說明1、本申請(qǐng)書適用于各門實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)23、格式要求一律用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊(cè)字體：中文用宋體，英文和數(shù)TimesNewRoman體，行距為1.5行距。（一（二（三”等依次分級(jí)編號(hào)，左起縮進(jìn)2字符，宋體加黑，字號(hào)為小四號(hào)。二級(jí)標(biāo)題：標(biāo)題編排應(yīng)采用“1、2、32字符，宋體加黑，字號(hào)為五號(hào)。內(nèi)容：字號(hào)為五號(hào)，每段第一行左起縮進(jìn)2字符4設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)目每人填寫一5、參考文獻(xiàn)按照《文后參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則》87)要求書寫6、本《申請(qǐng)書》各頁不夠可自行加、、 （元20145月至2014年9人E-（一）研究目試用于纖維性炎，于硬結(jié)區(qū)域內(nèi)注射，1次注射5mg～10mg后，多數(shù)癥狀即獲得明O2（超氧陰離子自由基O2身免疫等疾病。蘆薈SOD的活性回收率很高，采用最佳萃取條件可達(dá)87.2%，故大規(guī)模提取SOD的原料優(yōu)選為蘆薈。（二）國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分以前SOD的排他性不常溫保存血液的交及其潛在以國(guó)際生組呼吁立刻停止物D的用以人們漸將目轉(zhuǎn)到植物D蘆薈SD的活回收率很高，采用最佳萃取條件可達(dá)87.2%。蘆薈SOD逐漸成為動(dòng)物SOD的替代物。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)以蘆薈SOODSOSOD的提取率。（三）研究意（四）主要參考［］（）．中國(guó)．中國(guó)ＳＯＤ，２００５，４：５２－５３．１０：２３－２５，２００７，２４（３：５７－５９ ：１７－１９ Ｋｑ ｆ］ＳｆＣ ．Ｍ○—ｕｐｒｎ．Ｓｐ ．ａａ ｇｈａ ｖａｒａｏ． ｕｅｉｅｆ ｉｃ ａｔｉｏ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ．２００７，３４：１５６－１６ 化酶的純化和性質(zhì)研究．生物化學(xué) ，１９８９，５：１８２－１８４．［７］Ｊ．薩姆布克魯克，等．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南． ：科學(xué)技 ，２００２：１７１３－１７２２二、項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容（主要研究?jī)?nèi)容、擬解決的關(guān)鍵問題、創(chuàng)新點(diǎn)等（一）項(xiàng)目主要研究?jī)?nèi)（二）擬解決的關(guān)鍵問 蘆薈中提取SOD量的方法、 （三）創(chuàng)新采水相萃取技術(shù)，最大限度地利用了蘆薈SOD資源。拋棄了傳統(tǒng)的鹽析法、單獨(dú)的熱變性法三、項(xiàng)目實(shí)施方案（研究思路、技術(shù)路線、研究方法等（一）研究思（二）技術(shù)路 測(cè)（三）研究方 →勻漿過濾→濾液離心→取上清液→熱變形冷凍離心→取上清液→透析袋除雜→制作雙水相→雙水相萃取→SOD粗品離子交換層析SDS﹣PAGE（四）實(shí)施計(jì)1、蘆薈中的SOD粗品提植物原料均經(jīng)過去離子水洗滌，切成小塊放入多功能機(jī)，所得勻漿經(jīng)雙層紗布過濾兩次，合并濾液離心10min（4000r/min，室溫上清液并在60°C水浴下變性15min，10mn（8000/min，°CPEG-磷酸鹽雙水相的建PEG（K2HPO4KH2PO4）分別一定濃度的溶液，準(zhǔn)確量取一成相即可得到PEG-磷酸鹽雙水相體根據(jù)加入的PEG和磷酸鹽溶液的量算出PEG和磷酸鹽在PEGSOD10g，充分混合，靜止待上下分相。2、SOD的提氯仿﹣ 酶液置于冰浴中，緩慢加入一18。C預(yù)冷的，攪拌lO分鐘(操作需在離心管中進(jìn)行)。酶液過夜后，4500轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，棄沉淀，測(cè)定上清液的SOD酶與蛋白質(zhì)含量。 4、SDS電（1）分離膠的配分離膠緩沖液1．5mL，30％丙烯酰胺液2．5mL，10％過硫酸胺20μL，加水2mL。均勻，翻（2)濃縮臟的配按下列比例配濃縮膠：SDS1．5mL，30％丙烯酰胺0．5mL，10％過硫酸會(huì)后，3020μL，加入樣品槽。(5)染色和脫， ，（6）蛋白質(zhì)分子量的估5、離子交換層DEAE纖維素的處理、平衡和再吸去柱表面的溶液，使剩余的的溶液恰好進(jìn)入柱內(nèi)，再地用移液管加樣，也讓它恰好進(jìn)入柱床，用少量溶劑按同法加到柱內(nèi)，使樣品最后的殘留部分洗入柱床內(nèi)。最后，地將溶6、蛋白質(zhì)含量的測(cè)足至500HL，同時(shí)以兩管500#L的雙蒸水作空白對(duì)照。每管各加入5mL考馬斯亮蘭溶液，振蕩混7、酶的測(cè)定(1)鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)加入預(yù)熱的鄰苯三酚(10mmol／L鹽酸配制，對(duì)照管用lOmmol／LHCI代替)，迅速搖勻倒入lcm試 加入量 雙蒸 3mmol/L鄰苯三酚溶 總 (2)酶液的活性測(cè)表2—2測(cè)定SOD酶的試劑和酶液用試 雙蒸 酶 3mmol/L鄰苯三酚溶 總 [（0.070-樣品抑制速率）0.070]×100%SOD