動物細(xì)胞工程講課

1、植物細(xì)胞工程采用的兩項重要的基本技術(shù)是和2、兩項基本技術(shù)所依據(jù)的共同的理論基礎(chǔ)是3、體內(nèi)細(xì)胞全能性不表達(dá)而是分化為各種組織、器官的原因是4、植物組織培養(yǎng)需要經(jīng)歷的兩個基本環(huán)節(jié)是和其中前一環(huán)節(jié)的生成物為5、植物體細(xì)胞雜交操作的第一個障礙是細(xì)胞壁，去壁的方法為具體用到了和6、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有物理法和化學(xué)法，其中化學(xué)法用到的化學(xué)試劑為7、細(xì)胞融合完成的標(biāo)志為8、植物體細(xì)胞雜交的意義9、神奇的人工種子是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得再包上人工種皮制成的。10、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)，是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇等物質(zhì)，該環(huán)節(jié)只需組培到步。細(xì)胞工程專題二：1、操作的水平：2、操作的目的：3、分類：細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品植物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程(有別于基因工程)（操作對象）所依據(jù)的共同理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞工程采用的基本技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性1、概念1）受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞＞＞：已分化的細(xì)胞仍具有發(fā)育成完整個體的潛能，叫做細(xì)胞的全能性。2、原因3、全能性的比較：從理論上講，每個細(xì)胞都包含該物種的全部遺傳物質(zhì)（全部基因）.2）植物細(xì)胞

動物細(xì)胞（與細(xì)胞的分化程度有關(guān)）一般分化程度越低，全能性越高＞動物細(xì)胞的全能性受到了抑制，但細(xì)胞核還保留了全能性。4、體內(nèi)細(xì)胞全能性不表達(dá)而是分化為各種組織器官的原因是：在特定的時間和空間條件下，細(xì)胞中的基因選擇性表達(dá)出各種蛋白質(zhì)，從而構(gòu)成生物體不同的組織和器官。5、全能性實現(xiàn)的條件：離體在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用離體的植物器官組織或細(xì)胞外植體脫分化愈傷組織再分化植物體愈傷組織：排列疏松、高度液泡化的薄壁細(xì)胞團脫分化：已經(jīng)分化的細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞的過程再分化：由未分化的細(xì)胞形成具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)功能的細(xì)胞的過程分化程度很低，全能性很高。胚狀體叢芽1、植物組織培養(yǎng)的過程雜種植株融合的原生質(zhì)體AB再生壁脫分化愈傷組織再分化植物體細(xì)胞雜交的過程植物細(xì)胞的融合植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體B原生質(zhì)體A雜種細(xì)胞AB去壁去壁人工誘導(dǎo)動物細(xì)胞工程專題2細(xì)胞工程思考與回憶：1、動物細(xì)胞全能性特點？

隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄。細(xì)胞核仍具有全能性。2、能否用植物組織培養(yǎng)的方法使動物細(xì)胞發(fā)育成動物個體？

不能。動物細(xì)胞和組織在體外培養(yǎng)的過程中，伴隨一定的組織分化，不管采用什么手段和培養(yǎng)條件，由于細(xì)胞的運動、變化，細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)功能變異，結(jié)果長時間的培養(yǎng)只能使單一類型的細(xì)胞保存下來，最終成了簡單的細(xì)胞培養(yǎng)。3、動物的細(xì)胞培養(yǎng)的理論依據(jù)（原理）？

細(xì)胞增殖動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)核移植和克隆動物動物細(xì)胞工程常用技術(shù)其它動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)一：動物細(xì)胞培養(yǎng)本節(jié)內(nèi)容：一、動物細(xì)胞培養(yǎng)1、概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖.2、原理：細(xì)胞增殖定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動物器官組織剪碎單個細(xì)胞細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（貼壁生長長成單層細(xì)胞。有接觸抑制現(xiàn)象）。①原代培養(yǎng)3：過程圖示原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁過程■細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁?！雠囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附?！霎?dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時,細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。接觸抑制

定義：貼滿瓶壁的細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖。這樣的培養(yǎng)過程被稱為傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）傳代培養(yǎng)傳代細(xì)胞在傳至40-50代時，細(xì)胞增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止，這時部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化。傳代50代以后少數(shù)細(xì)胞會克服細(xì)胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了突變，正在朝著等同于癌細(xì)胞的方向發(fā)展。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳到10代就不易傳下去。10代以內(nèi)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)不變，保持正常二倍體核型。（冷凍保存的細(xì)胞為10代以內(nèi)的細(xì)胞）3、總結(jié)：動物細(xì)胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細(xì)胞懸液剪碎用胰蛋白酶處理10代細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細(xì)胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）為什么用胰蛋白酶處理？分瓶傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點：細(xì)胞貼壁、接觸抑制繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。遺傳物質(zhì)未改變：遺傳物質(zhì)已改變原代培養(yǎng)4.動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件:1）無菌無毒的環(huán)境：

適宜的溫度：人和哺乳動物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4液體合成培養(yǎng)基：（糖、氨基酸）、促生長因子、（水、無機鹽、微量元素）等；通常還需加入血漿、血清等天然成分。4）氣體環(huán)境：2）營養(yǎng)：3）溫度和pH：“95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細(xì)胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的PH。對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物，防止對培養(yǎng)細(xì)胞造成危害。問題3：為什么用胰蛋白酶處理？問題1：、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？因為其細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強，分化程度低。問題2、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？擴大細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)。動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)和細(xì)胞外的其他成分酶解，獲得單個細(xì)胞。

問題4：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？動物細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-7.4的動物細(xì)胞培養(yǎng)中無活性。問題5：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)的細(xì)胞消化掉嗎？控制好時間！長時間處理當(dāng)然會損傷細(xì)胞。問題6、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？問題7、動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機鹽）、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體問題8、動物細(xì)胞培養(yǎng)的原理：細(xì)胞增殖。問題9、目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常在10代以內(nèi)，為什么？10代以內(nèi)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。5.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:1.蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)如病毒疫苗(讓病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞，再將繁殖的病毒滅活)、干擾素、單克隆抗體2.應(yīng)用于基因工程主要用于作為受體細(xì)胞3.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性

4.細(xì)胞的生理、藥理、病理研究

如用于篩選抗癌藥物6、植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較：比較項目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的

細(xì)胞培養(yǎng)基特有成分

、植物激素葡萄糖、培養(yǎng)結(jié)果植物體培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得全能性增殖蔗糖動物血清細(xì)胞株、細(xì)胞系細(xì)胞,某些蛋白質(zhì)二、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物1、定義：

動物核移植是將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核,移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.3、分類：

胚胎核移植、體細(xì)胞核移植。胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易。動物體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難2、原理：

動物細(xì)胞核具有全能性4、體細(xì)胞核移植過程---示動物克隆---無性繁殖1.）克隆羊多利培育過程：黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利◆特別注意：克隆動物性狀與供體動物完全一樣嗎？不可能！因為：一、供體動物只提供細(xì)胞核，而細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)（如線粒體DNA）來自于受體卵母細(xì)胞.二、生物的性狀不僅與遺傳物質(zhì)有關(guān)，還受環(huán)境的影響。供體受體代孕受體黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核a重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利1、寫出AB所代表細(xì)胞工程名稱：a表示：

b表示:

2、實施細(xì)胞工程時，所需受體細(xì)胞大多采用卵母細(xì)胞的原因：體積大，易操作。含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。3、多利面部毛色是：

根據(jù)遺傳學(xué)原理說明判斷依據(jù)。4、若黑面綿羊的基因型為AA,白面綿羊的基因型為aa，則克隆羊的基因型為

核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都來自白面綿羊aa

◆取供體細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細(xì)胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？以概念圖的形式表示體細(xì)胞核移植過程？取供體細(xì)胞取卵母細(xì)胞

供體細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)到MⅡ中期

卵母細(xì)胞去核

供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞

供體核進入受體卵母細(xì)胞

重組胚胎

代孕母牛

生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的個體核移植胚胎移植核移植流程:1、供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)5、用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂進程。6電刺激促融使供體核進入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎。4、將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞3、顯微操作去除卵母細(xì)胞中的核2、受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)7、胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)8、妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)相同的犢牛。5.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景(1)、加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁殖(2)、保護瀕危動物(3)、生產(chǎn)醫(yī)用蛋白(4)、作為異種移植的供體6.體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題看書P49-50頁1.許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。2.成功率非常低及克隆動物食品的安全性問題。概念過程原理動物細(xì)胞培養(yǎng)條件應(yīng)用核移植技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植概念原理分類體細(xì)胞核移植過程前景、問題小結(jié)動物細(xì)胞融合與1、定義：指用自然或人工方法使兩個或多個不同的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的過程。三、動物細(xì)胞融合◆雜交細(xì)胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞成為雜交細(xì)胞。

細(xì)胞融合是正常的生命活動兩個細(xì)胞正在融合

受精作用2、原理：細(xì)胞膜的流動性3、誘導(dǎo)方法：物理方法：振動、電激、離心化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）生物方法：（最常用、特有）滅活的病毒（無感染性對各種動物細(xì)胞不造成破壞，保留抗原活性可使不同動物細(xì)胞進行融合）生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)融合.(利用滅活仙臺病毒是動物細(xì)胞融合所特有的。這是由于病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進細(xì)胞融合的功能。)病毒顆粒黏附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞思考討論：為什么細(xì)胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？

因為滅活的病毒能使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。4、結(jié)果：形成雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞特點？具有兩種細(xì)胞的遺傳特征原因是具有兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)5、意義：可突破有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能6、應(yīng)用：制備單克隆抗體動物細(xì)胞融合1、既然是抗體，就涉及到我們前面學(xué)過的哪一部分內(nèi)容？

2、抗體的化學(xué)本質(zhì)是什么？

3、抗體是由什么細(xì)胞產(chǎn)生的？

4、其他細(xì)胞能產(chǎn)生抗體嗎？為什么？

5、B細(xì)胞在什么情況下增殖分化為漿細(xì)胞分泌相應(yīng)抗體？

6、還有其他情況嗎？四、單克隆抗體的制備（1）傳統(tǒng)抗體的生產(chǎn)方法再從動物血清中分離抗體（2）該法制備抗體的缺點：產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。輸入漿細(xì)胞動物體內(nèi)

某抗體

某抗原1、傳統(tǒng)抗體的獲得怎樣才能獲得單克隆抗體？提示1：僅用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可行嗎？提示2：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無限增殖的？提示3：有什么方法能使?jié){細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和腫瘤細(xì)胞無限增殖能力同時具備呢？一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖雜種細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（1）、設(shè)計方案：動物細(xì)胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖2、單克隆抗體的制備米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎。（2）、單克隆抗體制備的原理◆利用

產(chǎn)生特異性抗體的功能?！衾?/p>

無限增殖的特性。◆利用

技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞?！衾?/p>

技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。漿細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是?將抗原注入動物體,然后從動物血清中提取抗體這種方法的缺點是什么?效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。運用已學(xué)知識，設(shè)想怎樣獲得單一類型的抗體？能否用單個B淋巴細(xì)胞通過克隆形成的細(xì)胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B淋巴細(xì)胞在體外不能無限增殖。四、單克隆抗體的制備思考單克隆抗體的制備—極富創(chuàng)造性的方案將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎。(3).單克隆抗體McAb（概念）由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖(克隆),

形成基因表達(dá)相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖雜種細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2.設(shè)計思路：動物細(xì)胞融合單克隆細(xì)胞系既能產(chǎn)生特異性抗體,又能大量繁殖單克隆抗體的制備單克隆抗體(3)、單克隆抗體制備過程雜交細(xì)胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體誘導(dǎo)其融合的方法有哪些？融合后培養(yǎng)液中有幾種細(xì)胞怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞有何優(yōu)點注射抗原的目的是什么為何要進行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測，多次篩選大量增殖雜交瘤細(xì)胞獲得單克隆抗體的方法單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備分離注射細(xì)胞融合提取小鼠B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞②專一抗體檢測克隆化培養(yǎng)單克隆抗體特定抗原多種細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞用選擇性培養(yǎng)基B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(B-瘤細(xì)胞)體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖B細(xì)胞瘤細(xì)胞篩選①多孔培養(yǎng)板1、抗原刺激的作用3、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合?B淋巴細(xì)胞－－分泌特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞－－能無限增殖小結(jié)：4、融合方法5、兩兩融合細(xì)胞種類2、從小鼠何處獲取B淋巴細(xì)胞？6、雜交瘤細(xì)胞的特點7、兩次篩選方法、目的繼承雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，既能產(chǎn)生專一抗體，又能無限增殖第一次特定的選擇性培養(yǎng)基雜交瘤細(xì)胞（除去什么細(xì)胞？）第二次克隆化培養(yǎng)和抗體檢測產(chǎn)生專一抗體的雜交瘤細(xì)胞（除去什么細(xì)胞？）單克隆抗體的制備經(jīng)過了幾次篩選？

※知識拓展：如何進行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？

融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。8、單克隆抗體的特點：9、骨髓瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞嗎?有無限增殖能力的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞，稱為癌細(xì)胞，所以說，瘤細(xì)胞不能等于癌細(xì)胞。10、此過程應(yīng)用了什么技術(shù)：動物細(xì)胞融合、動物細(xì)胞培養(yǎng)特異性強，靈敏度高單克隆抗體的制備過程中：單克隆指什么？

11、單克隆抗體含義：克隆單個雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體，即為單克隆抗體，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。這里的單克隆確有單個細(xì)胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細(xì)胞，而是雜交瘤細(xì)胞。動物特異性免疫分離B淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意B淋巴細(xì)胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細(xì)胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細(xì)胞。“克隆化培養(yǎng)”每個雜交瘤細(xì)胞，并進行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。選擇所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。提取單克隆抗體。1、單抗的制備過程要點：單克隆抗體的制備制備過程：1.注射抗原的目的是什么？2.誘導(dǎo)其融合的方法有哪些？3.融合后培養(yǎng)液中有幾種細(xì)胞？4.怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞有何優(yōu)點？5.為何要進行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測，多次篩選？6.大量增殖雜交瘤細(xì)胞獲得單抗的方法?3）、為何要進行兩次篩選？4）、如何進行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細(xì)胞。第1次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。問題強化：1）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體(1)作為診斷試劑：準(zhǔn)確識別各種抗原物質(zhì)的細(xì)微差異，并與一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合

3單克隆抗體的應(yīng)用優(yōu)點：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速（2）用于治療疾病和運載藥物：主要用于癌癥治療，可制成“生物導(dǎo)彈”生物導(dǎo)彈：抗癌細(xì)胞的單克隆抗體+放射性同位素或化學(xué)藥物或細(xì)胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。）優(yōu)點：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小）(1)作為診斷試劑：準(zhǔn)確識別各種抗原物質(zhì)的細(xì)微差異，并與一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合

3單克隆抗體的應(yīng)用優(yōu)點：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速(2)用于治療疾病和運載藥物①主要用于癌癥治療，②也可運載藥物，如“生物導(dǎo)彈”）（導(dǎo)向作用，作為載體，生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤）優(yōu)點：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用?。┛偨Y(jié)兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法

——滅活病毒一個新細(xì)胞——雜交瘤細(xì)胞一個優(yōu)勢——單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢單克隆抗體主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項目植物、動物細(xì)胞融合的比較動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)（基礎(chǔ)）生產(chǎn)單克隆抗體概念過程應(yīng)用應(yīng)用細(xì)胞核移植概念過程應(yīng)用構(gòu)建知識網(wǎng)絡(luò)植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞工程單克隆抗體細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)核移植植物細(xì)胞工程例題1：1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實驗室的科勒和米爾斯坦，把小鼠的淋巴細(xì)胞（脾細(xì)胞）和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合起來，成為雜交瘤細(xì)胞，實現(xiàn)在體外大量生產(chǎn)抗體的目的。實驗過程如圖所示。(1)淋巴細(xì)胞能與骨髓瘤細(xì)胞融合成一個細(xì)胞，兩種細(xì)胞膜也能“融合”在一起，說明細(xì)胞膜

。(2)單克隆抗體的準(zhǔn)確定義應(yīng)為()A．一類特殊抗體B．無性繁殖系

C．單一抗體細(xì)胞的無性繁殖第產(chǎn)生的抗體

D．單一抗體細(xì)胞的有性繁殖系產(chǎn)生的抗體(3)雜交瘤細(xì)胞繁殖進行的是_______分裂，其遺傳性狀__________。(4)單克隆抗體注入體內(nèi)后可以自動追蹤抗原(病原體或癌變細(xì)胞等)并與之結(jié)合，而絕不攻擊任何正常細(xì)胞，故稱為“生物導(dǎo)彈”這是利用了

_____________

。具有一定的流動性C有絲不變抗體能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特點

[例題2]（1）在用動物細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體時，將抗原注射到小鼠體內(nèi)，可獲得(多選)

（

）

A．T淋巴細(xì)胞B．效應(yīng)B淋巴細(xì)胞

C．抗體D．記憶細(xì)胞（2）下列關(guān)于單克隆抗體的制備和應(yīng)用的敘述中，正確的是(多選)（）

A．B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，一般需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)

B．融合后形成的雜交瘤細(xì)胞既能無限增殖，又能產(chǎn)生單克隆抗體

C．體外培養(yǎng)時，一個B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生一種抗體，但不能無限增殖

D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性明顯

BCD

AC