影響雞血細胞體外融合的各種因素分析,畜牧獸醫(yī)論文

影響雞血細胞體外融合的各種因素分析,畜牧獸醫(yī)論文細胞融合,又稱細胞雜交,是指在離體條件下人為地將不同種生物或者同種生物不同類型的單細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術.PEG法誘導細胞融合,細胞容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特制的儀器設備、操作方便、融合率較高,因此被廣泛用于細胞遺傳、細胞免疫、基因定位、病毒、腫瘤等基礎研究,也用于單克隆抗體制備和生物新品種培育,同時也被作為大學細胞工程實驗教學內(nèi)容.在實際操作中,該方式方法易受很多因素的影響,如PEG濃度、PEG作用時間、雞血細胞懸液濃度、雞血細胞懸液放置時間、鈣離子濃度等,致使有時融合率不高或不穩(wěn)定.本研究以家雞血紅細胞為材料,探尋求索影響細胞體外融合的各種因素,為動物細胞融合研究和細胞生物學相關實驗提供參考.1材料與方式方法1.1實驗材料及儀器公雞全血,PEG,NaCl,Hanks液,0.5%酚紅,GKN液.血細胞計數(shù)板,刻度離心管,離心機,水浴鍋,蓋玻片,容量瓶,載玻片,移液管等.1.2實驗方式方法1.2.10.85%NaCl溶液的配制稱取NaCl0.85g,溶于100mL的蒸餾水中.1.2.2GKN液的配制稱取NaCl8.0g、葡萄糖2.0g、Na2HPO42H2O1.77g、KCl0.4g、NaH2PO4H2O0.69g、酚紅0.01g,溶于1000mL的重蒸水中.1.2.3Hanks液的配制原液A:稱取NaCl16.0g、KCl8.0g、MgSO47H2O2.0g、MgCl26H2O2.0g、CaCl2(無水)2.8g,溶于雙蒸水至1000mL,濾紙過濾,儲存于4.0℃;原液B:葡萄糖20.0g、Na2HPO412H2O0.06g、KH2PO41.2g、雙蒸水800mL,用濾紙過濾,參加0.5%酚紅80mL,加水至1000mL,儲存于4.0℃.Hanks液:A、B液各1份,雙蒸水18份,用5.6%NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.4.1.2.4不同濃度的PEG溶液(m/V)的配制(1)分別稱取PEG6g置于4個小燒杯中,然后放入恒溫水浴鍋中水浴加熱,使其融化.(2)讓PEG緩慢冷卻到50~60℃,注意不要使PEG凝固.(3)向4個小燒杯中分別參加預熱至50℃的GKN液混勻,配制成10%,30%,50%,70%的PEG溶液.1.2.5雞血細胞懸液的配制(1)用注射器在雞翼下靜脈采血,注入試管后,迅速參加肝素(20U肝素/mL全血),混合均勻,制成抗凝全血.(2)向抗凝全血的試管中參加4倍體積的0.85%的生理鹽水溶液.混合均勻,制成紅細胞儲備液,4℃冰箱保存.(3)取1mL的雞血細胞儲備液于刻度離心管中,參加4mL0.85%的生理鹽水,混合均勻,放入低速離心機中,1000r/min條件下離心5min,棄上清.按上述條件再離心一次.(4)將沉淀物配制成懸浮液.并采用血球板計數(shù)法將懸浮液分別稀釋成細胞密度為1106,1107,1108個/mL的懸液.1.2.6細胞融合實驗方式方法(1)不同條件下細胞融合方式方法①不同雞血細胞懸液濃度下細胞融合方式方法分別取1mL細胞密度為1106,1107,1108個/mL的雞血細胞懸浮液(華而不實含有的CaCl2濃度為12.6mmol/L)到3支刻度離心管,分別參加4mLHanks液后混勻,1000r/min條件下離心5min,棄上清,通過用手指屢次輕彈離心管底部使沉淀的血細胞團塊變得松懈.向3支刻度離心管中分別參加0.5mL濃度為50%的PEG溶液(預熱至37℃),要沿管壁緩慢參加,邊加邊搖勻,參加后在37℃水浴鍋中靜置10min.②不同PEG濃度下細胞融合方式方法根據(jù)①的操作方式方法進行,華而不實1mL雞血細胞懸浮液的細胞密度固定為1107個/mL,參加濃度分別為10%,30%,50%,70%的PEG溶液.③不同PEG作用時間下細胞融合方式方法根據(jù)②的操作方式方法進行,華而不實PEG溶液的濃度固定為50%,參加PEG溶液后靜置時間分別為2,5,10,20min.④不同雞血細胞懸液放置時間下細胞融合方式方法根據(jù)③的操作方式方法進行,華而不實參加PEG溶液后靜置10min,1mL雞血細胞懸浮液分別放置5,10,15min后再參加到離心管中.⑤不同鈣離子濃度下細胞融合方式方法根據(jù)①的操作方式方法進行,華而不實1mL細胞密度為1107個/mL的雞血細胞懸浮液中含有的鈣離子濃度分別為0,12.6,50.0,75.0,100mmol/L.(2)終止PEG作用及染色觀察①向各離心管中緩慢參加5mLHanks液,然后輕輕吹打混勻,在37℃水浴鍋中靜置5min,終止PEG作用.②為使細胞團分散,屢次用吸管輕輕吹打細胞團,1000r/min條件下離心5min,使細胞完全沉降,棄上清.然后按上述條件,再次離心,棄上清,參加少許Hanks液,混勻.③在上述各離心管中參加JanusgreenB染液,用牙簽攪勻,染色3min.分別用不同的吸管汲取各刻度離心管中溶液制成裝片,在顯微鏡下觀察細胞融合情況.1.2.7細胞融合率計算細胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi),已發(fā)生融合的細胞其細胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細胞的細胞核總數(shù)的百分比.融合率(%)=(融合細胞核數(shù)/總細胞核數(shù))100%.每一處理制成3個裝片,每個裝片統(tǒng)計5個視野,細胞融合率取其平均值.2結果與分析2.1細胞融合經(jīng)過的觀察顯微鏡下觀察到的細胞融合經(jīng)過見圖1和圖2(箭頭所指),兩個細胞逐步靠近,細胞膜首先發(fā)生融合,然后再到細胞質,出現(xiàn)融合橋,最后細胞內(nèi)物質通過這種通道得到轉移.2.2不同雞血細胞懸液濃度對細胞融合率的影響細胞密度是影響細胞融合的重要因素之一.不同雞血細胞懸液濃度對雞血細胞融合率的影響結果見表1.表1數(shù)據(jù)顯示:雞血細胞密度為1107個/mL時融合效果最好,細胞融合率達到21.35%,這與李秀蘭等研究結果一致.【表1】2.3不同PEG濃度對雞血細胞融合率的影響PEG的體積分數(shù)大小是PEG融合技術的關鍵.由表2可知:同一細胞密度下,PEG體積分數(shù)50%時,細胞融合率與PEG的體積分數(shù)成正比;PEG體積分數(shù)為70%時,細胞融合率反而降低.由于PEG具有一定的毒性,體積分數(shù)越大對細胞的毒性越大,并且對融合率和融合后細胞的存活率影響也非常明顯,故PEG的體積分數(shù)一般為50%時細胞融合效果及融合后細胞的存活情況較好.【表2】2.4不同PEG作用時間對雞血細胞融合率的影響不同PEG作用時間對雞血細胞融合率的影響結果見表3.【表3】由表3可知:PEG作用時間10min時,細胞融合率隨著作用時間的延長呈增加趨勢;作用時間為10min時細胞融合率最大,達22.73%;作用時間為20min時細胞融合率為22.31%.固然下降不明顯,但部分細胞已經(jīng)破碎.因而,10min為最佳融合時間,這與仇燕等研究結果相一致.2.5不同雞血細胞懸液放置時間對細胞融合率的影響不同雞血細胞懸液放置時間對雞血細胞融合率的影響結果見表4.表4數(shù)據(jù)顯示,細胞懸液放置時間為10min時細胞融合率最大,達21.54%.因而,細胞懸液最佳放置時間為10min.【表4】2.6不同鈣離子濃度對雞血細胞融合率的影響表5統(tǒng)計結果講明:CaCl2濃度50.0mmol/L時,細胞融合率隨著鈣離子濃度的增大而增加.當CaCl2濃度50.0mmol/L時,細胞融合率隨著鈣離子濃度的增大而減少.鈣離子濃度為50mmol/L時細胞融合率到達最大,為21.58%.鈣離子濃度為100mmol/L時,細胞大部分破裂,細胞融合率為0.這與趙詠梅等研究結果基本一致.【表5】3討論PEG是普遍應用的融合劑,它與水分子的氫鍵結合,導致細胞質膜構造發(fā)生變化,使細胞接觸的部位膜脂雙層中磷脂分子發(fā)陌生散,細胞膜構造發(fā)生重排,然后使細胞胞質溝通,互相接觸的細胞發(fā)生融合.影響PEG誘導細胞融合的因素很多,如細胞密度、PEG濃度、PEG作用時間、鈣離子濃度等,將影響細胞融合的因素進行合理的組合就能獲得較高的細胞融合率.研究表示清楚,雞血細胞融合的最適溫度為37℃.在這里條件下,本實驗證明PEG的最適體積分數(shù)為50%,在最適PEG體積分數(shù)下,細胞融合的最適時間即PEG作用時間為10min,若超過10min,PEG作用時間越長,對細胞毒害越大,最終會致使細胞破裂.細胞密度為1107個/mL時融合效果最好,細胞懸液放置10min時細胞融合率最大.鈣離子濃度對細胞融合也有明顯的影響,本實驗結果表明:當CaCl2濃度為50mmol/L時,細胞體外融合效果最好,融合率高達21.58%.當然,細胞的種類不同,也會導致融合時的最適條件也有差異不同,有待進一步研究.細胞融合技術為單克隆抗體和抗腫瘤疫苗的制備以及動物、植物遠緣雜交育種開拓了新途徑.伴隨著細胞融合技術的改良,其在各個領域被充分應用,在實際應用中又不斷伴隨著新的問題出現(xiàn),在解決實際問題中又促使細胞融合技術躍上一個又一個新的臺階.PEG法以其低廉的成本實現(xiàn)相對較高的融合率,在很多實驗中應用愈加廣泛.因而,對于PEG化學融合方式方法的改良有著特別重要的意義.除此之外,PEG化學融合方式方法與其他學科的技術穿插,例如物理、計算機科學等,也將會是細胞融合技術發(fā)展的新方向.以下為參考文獻:[1]劉哲,張峰,佟丹丹,等.雞紅細胞體外融合最適條件的研究[J].遼東學院學報,2018,16(4):335-337.[2]趙彥禹,張艷華,馮照軍.雞紅細胞融合最適條件的討論[J].生物磁學,2006