影響雞血細(xì)胞體外融合的各種因素分析,畜牧獸醫(yī)論文

影響雞血細(xì)胞體外融合的各種因素分析,畜牧獸醫(yī)論文細(xì)胞融合,又稱細(xì)胞雜交,是指在離體條件下人為地將不同種生物或者同種生物不同類型的單細(xì)胞通過無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù).PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合,細(xì)胞容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特制的儀器設(shè)備、操作方便、融合率較高,因此被廣泛用于細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、基因定位、病毒、腫瘤等基礎(chǔ)研究,也用于單克隆抗體制備和生物新品種培育,同時(shí)也被作為大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容.在實(shí)際操作中,該方式方法易受很多因素的影響,如PEG濃度、PEG作用時(shí)間、雞血細(xì)胞懸液濃度、雞血細(xì)胞懸液放置時(shí)間、鈣離子濃度等,致使有時(shí)融合率不高或不穩(wěn)定.本研究以家雞血紅細(xì)胞為材料,探尋求索影響細(xì)胞體外融合的各種因素,為動(dòng)物細(xì)胞融合研究和細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考.1材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器公雞全血,PEG,NaCl,Hanks液,0.5%酚紅,GKN液.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,刻度離心管,離心機(jī),水浴鍋,蓋玻片,容量瓶,載玻片,移液管等.1.2實(shí)驗(yàn)方式方法1.2.10.85%NaCl溶液的配制稱取NaCl0.85g,溶于100mL的蒸餾水中.1.2.2GKN液的配制稱取NaCl8.0g、葡萄糖2.0g、Na2HPO42H2O1.77g、KCl0.4g、NaH2PO4H2O0.69g、酚紅0.01g,溶于1000mL的重蒸水中.1.2.3Hanks液的配制原液A:稱取NaCl16.0g、KCl8.0g、MgSO47H2O2.0g、MgCl26H2O2.0g、CaCl2(無(wú)水)2.8g,溶于雙蒸水至1000mL,濾紙過濾,儲(chǔ)存于4.0℃;原液B:葡萄糖20.0g、Na2HPO412H2O0.06g、KH2PO41.2g、雙蒸水800mL,用濾紙過濾,參加0.5%酚紅80mL,加水至1000mL,儲(chǔ)存于4.0℃.Hanks液:A、B液各1份,雙蒸水18份,用5.6%NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.4.1.2.4不同濃度的PEG溶液(m/V)的配制(1)分別稱取PEG6g置于4個(gè)小燒杯中,然后放入恒溫水浴鍋中水浴加熱,使其融化.(2)讓PEG緩慢冷卻到50~60℃,注意不要使PEG凝固.(3)向4個(gè)小燒杯中分別參加預(yù)熱至50℃的GKN液混勻,配制成10%,30%,50%,70%的PEG溶液.1.2.5雞血細(xì)胞懸液的配制(1)用注射器在雞翼下靜脈采血,注入試管后,迅速參加肝素(20U肝素/mL全血),混合均勻,制成抗凝全血.(2)向抗凝全血的試管中參加4倍體積的0.85%的生理鹽水溶液.混合均勻,制成紅細(xì)胞儲(chǔ)備液,4℃冰箱保存.(3)取1mL的雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液于刻度離心管中,參加4mL0.85%的生理鹽水,混合均勻,放入低速離心機(jī)中,1000r/min條件下離心5min,棄上清.按上述條件再離心一次.(4)將沉淀物配制成懸浮液.并采用血球板計(jì)數(shù)法將懸浮液分別稀釋成細(xì)胞密度為1106,1107,1108個(gè)/mL的懸液.1.2.6細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)方式方法(1)不同條件下細(xì)胞融合方式方法①不同雞血細(xì)胞懸液濃度下細(xì)胞融合方式方法分別取1mL細(xì)胞密度為1106,1107,1108個(gè)/mL的雞血細(xì)胞懸浮液(華而不實(shí)含有的CaCl2濃度為12.6mmol/L)到3支刻度離心管,分別參加4mLHanks液后混勻,1000r/min條件下離心5min,棄上清,通過用手指屢次輕彈離心管底部使沉淀的血細(xì)胞團(tuán)塊變得松懈.向3支刻度離心管中分別參加0.5mL濃度為50%的PEG溶液(預(yù)熱至37℃),要沿管壁緩慢參加,邊加邊搖勻,參加后在37℃水浴鍋中靜置10min.②不同PEG濃度下細(xì)胞融合方式方法根據(jù)①的操作方式方法進(jìn)行,華而不實(shí)1mL雞血細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞密度固定為1107個(gè)/mL,參加濃度分別為10%,30%,50%,70%的PEG溶液.③不同PEG作用時(shí)間下細(xì)胞融合方式方法根據(jù)②的操作方式方法進(jìn)行,華而不實(shí)PEG溶液的濃度固定為50%,參加PEG溶液后靜置時(shí)間分別為2,5,10,20min.④不同雞血細(xì)胞懸液放置時(shí)間下細(xì)胞融合方式方法根據(jù)③的操作方式方法進(jìn)行,華而不實(shí)參加PEG溶液后靜置10min,1mL雞血細(xì)胞懸浮液分別放置5,10,15min后再參加到離心管中.⑤不同鈣離子濃度下細(xì)胞融合方式方法根據(jù)①的操作方式方法進(jìn)行,華而不實(shí)1mL細(xì)胞密度為1107個(gè)/mL的雞血細(xì)胞懸浮液中含有的鈣離子濃度分別為0,12.6,50.0,75.0,100mmol/L.(2)終止PEG作用及染色觀察①向各離心管中緩慢參加5mLHanks液,然后輕輕吹打混勻,在37℃水浴鍋中靜置5min,終止PEG作用.②為使細(xì)胞團(tuán)分散,屢次用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán),1000r/min條件下離心5min,使細(xì)胞完全沉降,棄上清.然后按上述條件,再次離心,棄上清,參加少許Hanks液,混勻.③在上述各離心管中參加JanusgreenB染液,用牙簽攪勻,染色3min.分別用不同的吸管汲取各刻度離心管中溶液制成裝片,在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況.1.2.7細(xì)胞融合率計(jì)算細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi),已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)的百分比.融合率(%)=(融合細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù))100%.每一處理制成3個(gè)裝片,每個(gè)裝片統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野,細(xì)胞融合率取其平均值.2結(jié)果與分析2.1細(xì)胞融合經(jīng)過的觀察顯微鏡下觀察到的細(xì)胞融合經(jīng)過見圖1和圖2(箭頭所指),兩個(gè)細(xì)胞逐步靠近,細(xì)胞膜首先發(fā)生融合,然后再到細(xì)胞質(zhì),出現(xiàn)融合橋,最后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過這種通道得到轉(zhuǎn)移.2.2不同雞血細(xì)胞懸液濃度對(duì)細(xì)胞融合率的影響細(xì)胞密度是影響細(xì)胞融合的重要因素之一.不同雞血細(xì)胞懸液濃度對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響結(jié)果見表1.表1數(shù)據(jù)顯示:雞血細(xì)胞密度為1107個(gè)/mL時(shí)融合效果最好,細(xì)胞融合率達(dá)到21.35%,這與李秀蘭等研究結(jié)果一致.【表1】2.3不同PEG濃度對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響PEG的體積分?jǐn)?shù)大小是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵.由表2可知:同一細(xì)胞密度下,PEG體積分?jǐn)?shù)50%時(shí),細(xì)胞融合率與PEG的體積分?jǐn)?shù)成正比;PEG體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),細(xì)胞融合率反而降低.由于PEG具有一定的毒性,體積分?jǐn)?shù)越大對(duì)細(xì)胞的毒性越大,并且對(duì)融合率和融合后細(xì)胞的存活率影響也非常明顯,故PEG的體積分?jǐn)?shù)一般為50%時(shí)細(xì)胞融合效果及融合后細(xì)胞的存活情況較好.【表2】2.4不同PEG作用時(shí)間對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響不同PEG作用時(shí)間對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響結(jié)果見表3.【表3】由表3可知:PEG作用時(shí)間10min時(shí),細(xì)胞融合率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì);作用時(shí)間為10min時(shí)細(xì)胞融合率最大,達(dá)22.73%;作用時(shí)間為20min時(shí)細(xì)胞融合率為22.31%.固然下降不明顯,但部分細(xì)胞已經(jīng)破碎.因而,10min為最佳融合時(shí)間,這與仇燕等研究結(jié)果相一致.2.5不同雞血細(xì)胞懸液放置時(shí)間對(duì)細(xì)胞融合率的影響不同雞血細(xì)胞懸液放置時(shí)間對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響結(jié)果見表4.表4數(shù)據(jù)顯示,細(xì)胞懸液放置時(shí)間為10min時(shí)細(xì)胞融合率最大,達(dá)21.54%.因而,細(xì)胞懸液最佳放置時(shí)間為10min.【表4】2.6不同鈣離子濃度對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響表5統(tǒng)計(jì)結(jié)果講明:CaCl2濃度50.0mmol/L時(shí),細(xì)胞融合率隨著鈣離子濃度的增大而增加.當(dāng)CaCl2濃度50.0mmol/L時(shí),細(xì)胞融合率隨著鈣離子濃度的增大而減少.鈣離子濃度為50mmol/L時(shí)細(xì)胞融合率到達(dá)最大,為21.58%.鈣離子濃度為100mmol/L時(shí),細(xì)胞大部分破裂,細(xì)胞融合率為0.這與趙詠梅等研究結(jié)果基本一致.【表5】3討論P(yáng)EG是普遍應(yīng)用的融合劑,它與水分子的氫鍵結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜構(gòu)造發(fā)生變化,使細(xì)胞接觸的部位膜脂雙層中磷脂分子發(fā)陌生散,細(xì)胞膜構(gòu)造發(fā)生重排,然后使細(xì)胞胞質(zhì)溝通,互相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合.影響PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的因素很多,如細(xì)胞密度、PEG濃度、PEG作用時(shí)間、鈣離子濃度等,將影響細(xì)胞融合的因素進(jìn)行合理的組合就能獲得較高的細(xì)胞融合率.研究表示清楚,雞血細(xì)胞融合的最適溫度為37℃.在這里條件下,本實(shí)驗(yàn)證明PEG的最適體積分?jǐn)?shù)為50%,在最適PEG體積分?jǐn)?shù)下,細(xì)胞融合的最適時(shí)間即PEG作用時(shí)間為10min,若超過10min,PEG作用時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞毒害越大,最終會(huì)致使細(xì)胞破裂.細(xì)胞密度為1107個(gè)/mL時(shí)融合效果最好,細(xì)胞懸液放置10min時(shí)細(xì)胞融合率最大.鈣離子濃度對(duì)細(xì)胞融合也有明顯的影響,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)CaCl2濃度為50mmol/L時(shí),細(xì)胞體外融合效果最好,融合率高達(dá)21.58%.當(dāng)然,細(xì)胞的種類不同,也會(huì)導(dǎo)致融合時(shí)的最適條件也有差異不同,有待進(jìn)一步研究.細(xì)胞融合技術(shù)為單克隆抗體和抗腫瘤疫苗的制備以及動(dòng)物、植物遠(yuǎn)緣雜交育種開拓了新途徑.伴隨著細(xì)胞融合技術(shù)的改良,其在各個(gè)領(lǐng)域被充分應(yīng)用,在實(shí)際應(yīng)用中又不斷伴隨著新的問題出現(xiàn),在解決實(shí)際問題中又促使細(xì)胞融合技術(shù)躍上一個(gè)又一個(gè)新的臺(tái)階.PEG法以其低廉的成本實(shí)現(xiàn)相對(duì)較高的融合率,在很多實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用愈加廣泛.因而,對(duì)于PEG化學(xué)融合方式方法的改良有著特別重要的意義.除此之外,PEG化學(xué)融合方式方法與其他學(xué)科的技術(shù)穿插,例如物理、計(jì)算機(jī)科學(xué)等,也將會(huì)是細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展的新方向.以下為參考文獻(xiàn):[1]劉哲,張峰,佟丹丹,等.雞紅細(xì)胞體外融合最適條件的研究[J].遼東學(xué)院學(xué)報(bào),2018,16(4):335-337.[2]趙彥禹,張艷華,馮照軍.雞紅細(xì)胞融合最適條件的討論[J].生物磁學(xué),2006