實(shí)驗(yàn)四產(chǎn)物的載體克隆和轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)四產(chǎn)物的載體克隆和轉(zhuǎn)化第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)操作步驟第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要步驟：①制備目的基因和選擇相關(guān)載體②目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接③重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日

（三）PCR擴(kuò)增特定基因

（四）人工合成一、目的基因的獲得——分

（一）從基因組文庫中獲得

（二）從cDNA文庫中獲得第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫-++-cDNA文庫++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達(dá)++--二、載體的選擇與準(zhǔn)備——選第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、DNA分子的體外連接——接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）黏性末端第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日（二）人工接頭第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)粒混合、退火空白質(zhì)粒第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日（四）平端連接第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′5′第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞——轉(zhuǎn)受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。五、目的基因的篩選和鑒定——篩第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

(1)利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達(dá)特性篩選(3)利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）

遺傳學(xué)方法1.插入滅活法第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日插入失活篩選帶有重組載體的克隆第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日α互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR產(chǎn)物的T載體

克隆和轉(zhuǎn)化

第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)T載體的特點(diǎn)和PCR產(chǎn)物的克隆方法。實(shí)驗(yàn)要求：

掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物的方法；復(fù)習(xí)連接實(shí)驗(yàn)流程。技術(shù)應(yīng)用：

目的基因片段與T載體DNA連接，達(dá)到克隆基因的目的。第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日材料：目的基因片段（回收的PCR產(chǎn)物）藥品：pEMGT-Vector(Promega公司)第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日

質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA

分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1~3個抗藥性基因，以利于篩選。第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_(dá)的質(zhì)粒載體

允許外源DNA的插入、儲存和表達(dá)。第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日第三十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理普通Taq酶會在3′末端加一個A，這樣所有PCR產(chǎn)物都會在雙鏈DNA的3′端均有一個單鏈狀態(tài)的A；T-載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3′端均有一個單鏈狀態(tài)的T；二者在連接酶的作