實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡構(gòu)造及使用

實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡構(gòu)造及使用第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日本學(xué)期細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開設(shè)項(xiàng)目和時(shí)間安排序號項(xiàng)目名稱學(xué)時(shí)性質(zhì)01顯微技術(shù)總論（光學(xué)顯微鏡構(gòu)造及使用）6綜合性02葉綠體的提取分離和熒光觀察3綜合性03細(xì)胞器的超活染色技術(shù)3驗(yàn)證性04哺乳類紅細(xì)胞綜合實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞凝集和低滲溶血）3驗(yàn)證性05巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象觀察3驗(yàn)證性06植物染色體標(biāo)本制作和組型分析6綜合性07動物染色體標(biāo)本制作技術(shù)3綜合性08動物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微觀察6綜合性09染色體核仁組織區(qū)的銀染色法3驗(yàn)證性10雞紅細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)3驗(yàn)證性11生物制片技術(shù)6綜合性第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日

光學(xué)顯微鏡構(gòu)造和使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解和掌握普通光鏡、暗視場顯微鏡、相差、熒光、微分干涉差、倒置等顯微鏡的原理和使用方法。同時(shí)簡單介紹電鏡原理。2．了解掌握光學(xué)顯微鏡的光路合軸方法，了解顯微攝影的基本操作。第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、原理和方法一）普通（明場）光學(xué)顯微鏡1．普通明場光學(xué)顯微鏡各零部件構(gòu)成：鏡座、柱、筒、臂、轉(zhuǎn)換器、載物臺、調(diào)節(jié)器、光源及光源聚光鏡，視場光闌、孔徑光闌、鏡臺下聚光器、聚光器前透鏡、物鏡和目鏡。2．物鏡的種類：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、平場物鏡。3．顯微鏡的光路原理（略）光源色光→視場光闌—折射→孔徑光闌→聚光鏡→樣品在物鏡后焦平面成像→目鏡觀察第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日4．顯微性能參數(shù)顯微鏡的性能參數(shù)包括分辨率、放大率，焦點(diǎn)深度、視場寬度等。1）分辨率：R=0.61λ/N.A.；N.A.＝ｎsinα/2式中：n=介質(zhì)折射率；α=孔徑角（鏡口角，物鏡最邊緣斜光線與顯微鏡光軸所成的交角），N.A.=數(shù)值孔徑（鏡口率，numericaperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。2）顯微鏡總放大率（Mt）=物鏡放大率×目鏡放大率×攝影透鏡放大率；有效放大率=物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍，故需根據(jù)物鏡選配適宜的目鏡。第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日5．顯微鏡的使用1）光路合軸：鏡檢與攝影前，使照明光線與顯微鏡光軸合一即為光路合軸，整個(gè)過程涉及到聚光器調(diào)中和光源燈絲調(diào)中兩部分，詳細(xì)過程參閱教材。2）光闌的調(diào)節(jié)：視場光闌用于控制照明光束可以限定視場大??；孔徑光闌用于限定聚光器孔徑大小。調(diào)節(jié)時(shí)以視場光闌內(nèi)緣外切孔徑光闌為基準(zhǔn)。3）各種特殊光學(xué)構(gòu)件的安裝、調(diào)試和使用（以BX-50系統(tǒng)顯微鏡為例）第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日OLYMPUSBX50

系統(tǒng)顯微鏡組成部分第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日OLYMPUSBX50第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日光強(qiáng)預(yù)置旋鈕粗細(xì)準(zhǔn)焦旋鈕第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日激發(fā)模塊第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日萬能聚光鏡孔徑光欄拉桿第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日萬能聚光鏡視場光闌調(diào)節(jié)環(huán)第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日光路合軸調(diào)中①轉(zhuǎn)動聚光鏡高度升降旋鈕把聚光鏡升高到最高位置；②放入樣品，將DIC、起偏器等光學(xué)附件移出光路，聚光鏡轉(zhuǎn)到明場上；③用4X或10X物鏡聚焦，調(diào)至清晰；④視場光闌打至最??；⑤通過調(diào)節(jié)聚光鏡升降旋鈕下降聚光鏡，使視場中出現(xiàn)清晰正多邊形圖像；

⑥通過調(diào)節(jié)聚光鏡中心調(diào)節(jié)旋鈕，把正多邊形圖像移至視場中心位置；⑦逐步打開視場光闌，如正多邊形與視場邊緣內(nèi)切，則聚光鏡已正確對中；⑧實(shí)際觀察中，稍加大視場光闌，使它的圖象剛好與視場外切即可。⑤⑥⑦⑧第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日光路合軸調(diào)中過程第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日調(diào)節(jié)裝置第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日二）暗視野顯微鏡特殊部件：暗視野聚光器/暗視野光擋1．由于聚光器構(gòu)造的特殊性，導(dǎo)致直射光線不能進(jìn)入視野，此時(shí)視野黑暗。光線斜向照射時(shí)，樣品產(chǎn)生散射光，一部分散射光線可以進(jìn)入視野，在黑暗視野中樣品邊緣明亮。2．暗視野光檔：光擋直徑取決于物鏡數(shù)值孔徑，光擋恰好能擋住物鏡通光孔徑。另一個(gè)問題是暗視場聚光器的調(diào)中。第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日暗視野光擋第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日暗視野顯微鏡調(diào)節(jié)使用開啟照明光源明場（BF）聚焦轉(zhuǎn)動萬能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至DFA起偏器拉出光路檢偏器拉出光路調(diào)節(jié)孔徑光欄至可見樣品調(diào)節(jié)載物臺使樣品聚焦取下目鏡，觀察物鏡外緣，調(diào)節(jié)并對中暗場環(huán)裝置；裝好目鏡觀察暗場圖像，重復(fù)對中直至獲得光學(xué)暗場效果圖像上下移動聚光鏡直到獲得均勻的暗場照明將視場光闌開大到獲得均勻亮度的程度第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日三）倒置顯微鏡光源在上，物鏡在下，光路設(shè)計(jì)與普通顯微鏡正好相反，經(jīng)常用于觀察工作距離較大的樣品，如觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日四）相差顯微鏡部件構(gòu)成：環(huán)狀光闌，相差物鏡1．這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。光線經(jīng)環(huán)狀光闌投射樣品的直射光和衍射光透過物鏡相差板時(shí)，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后相互干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高反差，造成不同的反差效果。2．聚光器調(diào)中，需要借助調(diào)中望遠(yuǎn)鏡調(diào)中。第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日相差物鏡第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日對中望遠(yuǎn)鏡第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日相差顯微鏡調(diào)節(jié)使用開啟照明光源明場（BF）聚焦轉(zhuǎn)動萬能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至Ph（X），使匹配的環(huán)狀光闌進(jìn)入光路選擇與聚光鏡相匹配的同型物鏡Ph（X）起偏器拉出光路檢偏器拉出光路打開孔徑光闌（孔徑光闌太小中央可能產(chǎn)生眩光）對樣品聚焦，取下目鏡（可換上調(diào)中望遠(yuǎn)鏡,CT），調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌對中螺絲，使亮環(huán)和暗環(huán)在視場內(nèi)重疊，（更換不同倍率物鏡需重復(fù)調(diào)節(jié)）取下對中望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡觀察（可插入綠色干涉濾色片，以增大反差）。第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日五）偏光顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+檢偏器偏光顯微鏡用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有起偏器，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器。檢偏器偏振方向與起偏器垂直時(shí)則為正交偏光鏡，這種顯微鏡的載物臺一般是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日簡易偏光顯微鏡調(diào)節(jié)使用開啟照明光源明場（BF）聚焦起偏器推入光路檢偏器（U-ANT）推入光路調(diào)節(jié)起偏器旋轉(zhuǎn)旋鈕以獲得暗場（正交尼科爾位置）并固緊旋鈕調(diào)節(jié)孔徑光欄與光照強(qiáng)度至最佳效果（關(guān)小孔徑光闌可增大圖像反差）第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日起偏器拔出狀態(tài)視場光闌調(diào)節(jié)環(huán)第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日檢偏器拔出狀態(tài)第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日六）微分干涉差顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+DIC棱鏡+DIC滑行器+檢偏器偏振器裝在聚光器的前面，使光線發(fā)生線性偏振，聚光器前的DIC棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，兩束光產(chǎn)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)DIC棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器，檢偏器與起偏器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差，成像效果有浮雕立體感。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，改變影像的亮度，使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，三維立體感明顯。第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日微分干涉差顯微鏡調(diào)節(jié)使用開啟照明光源明場（BF）聚焦起偏器推入光路DIC滑座（附檢偏器）推入光路，固緊螺絲順時(shí)針把DIC棱鏡控制鈕旋轉(zhuǎn)到頭取下目鏡可見物鏡外緣，同時(shí)調(diào)節(jié)起偏器旋鈕至黑色條紋最黑的位置（若為兩條黑紋，起偏器旋轉(zhuǎn)90o，以使只可見一條黑色條紋）固緊起偏器旋鈕；目鏡復(fù)位，轉(zhuǎn)動萬能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至DP（DIC棱鏡）進(jìn)入光路樣品聚焦（樣品要表面干凈），調(diào)節(jié)孔徑光欄與光照強(qiáng)度至最佳浮雕效果（調(diào)節(jié)視場光闌與視場外切，縮小孔徑光闌可增大反差）旋轉(zhuǎn)DIC調(diào)節(jié)鈕可調(diào)節(jié)背景干涉色，灰色到品紅色連續(xù)變化（100-600nm)背景黑色時(shí)為類暗場效果，灰色則獲得最大反差的三維圖像，品紅色則很小的光學(xué)延滯都可觀察到顏色變化，如結(jié)合可旋轉(zhuǎn)載物臺則干涉差的方向靈敏性可表現(xiàn)出來。第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日DIC滑行器（U-DICT），上附檢偏器（U-ANT或U-AN）棱鏡控制旋鈕第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日DIC顯微鏡下的硅藻第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日七）熒光顯微鏡1．短波光照射樣品導(dǎo)致熒光分子被激發(fā)，分子能級躍遷，以光子的形式釋放能量。2．光源：高壓汞燈，使用時(shí)需要預(yù)熱十五分鐘，斷電后十分鐘內(nèi)不能重啟。3．濾色鏡：包括激發(fā)光濾鏡和阻斷濾鏡。4．汞燈使用前需聚焦調(diào)中。第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日激發(fā)模塊第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日紫外防護(hù)罩第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日汞燈第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日汞燈調(diào)中檢驗(yàn)器第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日①為了延長高壓汞燈的使用壽命，一旦啟動，不能在少于15分鐘內(nèi)關(guān)閉。關(guān)閉高壓汞燈后，至少10分鐘后才能再次啟動。②轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤或插入濾光片時(shí)始終要停在聽到卡嗒聲處。如果偏離這個(gè)位置，遮光板會由于過熱而變形。第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日熒光顯微調(diào)節(jié)裝置第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡使用注意事項(xiàng)1.紫外光有害，注意保護(hù)眼、皮膚2.熒光弱，曝光時(shí)間長，需注意防震3.保護(hù)標(biāo)本，避免長時(shí)間曝光對標(biāo)本的照射4.標(biāo)本制作過程中要注意清潔、環(huán)境干凈5.暗室條件第四十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日八)電子顯微鏡電