第八章生長繁殖

第八章

微生物的生長繁殖及其控制第一節(jié)微生物生長的研究方法一、微生物的分離純化方法：（1）平皿劃線法（2）稀釋倒平皿法（3）稀釋涂布法（4）選擇培養(yǎng)基分離法（5）單細胞挑取法（6）利用環(huán)境條件控制法二、實驗室培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)：試管、平皿、三角瓶厭氧菌的固體培養(yǎng)高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿Hungaterool-tubetechnique厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)液體培養(yǎng)法好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)試管液體培養(yǎng)三角瓶淺層液體培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐搖瓶培養(yǎng)..................Brewer皿.....................高層瓊脂柱亨蓋特技術(shù)培養(yǎng)厭氧菌的試管及平皿AnaerobicGloveBox三、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物固態(tài)培養(yǎng)法好氧菌-曲法培養(yǎng)厭氧菌的堆積培養(yǎng)深層液體通氣培養(yǎng)——發(fā)酵罐（Fermenter）液體培養(yǎng)法淺盤培養(yǎng)三、測定生長繁殖的方法既然生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定生長的方法也都直接或間接地以此為根據(jù)，而測定繁殖要建立在計數(shù)這一基礎上。一、微生物細胞數(shù)目的測定（一）比濁法細菌培養(yǎng)物在其生長過程中，由于原生質(zhì)含量的增加，會引起培養(yǎng)物渾濁度的增高。如果要作精確測定，則可用分光光度計進行。在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。實驗測量時應控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確。直接計數(shù)法只適用于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子。1、比例計數(shù)法將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細胞細胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細胞濃度。（二）直接計數(shù)法直接法就是指在顯微鏡下直接觀察細胞并進行計數(shù)的方法，所得的結(jié)果是包括死細菌在內(nèi)的總菌數(shù)。采用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板，在顯微鏡下對微生物數(shù)量進行直接計數(shù)（計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量）缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；2、血球計數(shù)板法用來測定一定容積中的細胞總數(shù)目的常規(guī)方法。（三）平板菌落計數(shù)法一種活菌計數(shù)法，是根據(jù)活細胞通過生長繁殖會在平板培養(yǎng)基表面形成菌落的原理而設計的方法。對未知樣品進行一系列十倍稀釋，然后取一定體積的稀釋菌液涂布于瓊脂平板上，保溫培養(yǎng)直到菌落出現(xiàn)，記錄菌落數(shù)目并換算成每毫升試樣中的活細胞總數(shù)。它是一種最常用的活菌計數(shù)法采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求操作熟練、準確，否則難以得到正確的結(jié)果：樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；同一稀釋度三個以上重復,取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準確計數(shù)；涂布平板法和稀釋倒平板法一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細胞數(shù)。以上介紹了若干測定微生物的生長繁殖數(shù)的主要方法，其中，最常用的為測濁度（用分光光度計）、用計數(shù)板測總菌數(shù)以及用平板菌落計數(shù)法測活菌數(shù)等方法。在使用前，一定要根據(jù)自己的研究對象和研究目的的不同，選用最合適的方法。3、測含氮量根據(jù)樣品中菌體蛋白質(zhì)含量計算微生物重量的方法。氮是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定成分(蛋白質(zhì)量=6.25×總含N量)4、測含碳量5、其他（例如：磷、DNA、RNA等）1、濕重法2、稱干重可用離心或過濾后干燥，稱重，一般干重為濕重的10~20%。二、測定生物量和生理指標與生長量相平行的生理指標很多，它們都可用作生長測定中的相對值。微生物的生理指標，如呼吸強度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。常用于對微生物的快速鑒定與檢測生物個體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導致個體體積擴大的生物學過程。生長：生物個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學過程。繁殖：生長、繁殖就是保證微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提第二節(jié)微生物的生長規(guī)律微生物的生長表現(xiàn)在微生物的個體生長和群體生長兩個水平上。個體生長個體繁殖群體生長在微生物學中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大生物時有所不同。在一定時間和條件下細胞數(shù)量的增加（微生物群體生長）微生物生長:一、個體生長和同步生長要研究單個細菌細胞內(nèi),所發(fā)生的生物化學變化和細胞學變化,目前使用的方法:一是用電子顯微鏡觀察細菌細胞的超薄切片二是使用同步培養(yǎng)技術(shù)(Synchronousculture)同步培養(yǎng):設法使群體中的所有細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期中,然后分析此群體的各種生物化學特征,從而了解單個細胞所發(fā)生的變化。同步生長：這種通過同步培養(yǎng)而使細胞群體處于分裂步調(diào)一致的狀態(tài)，就稱同步生長。獲得細菌同步生長的方法主要有兩類：通過環(huán)境條件來誘導同步性溫度培養(yǎng)基成份控制其他：如光照和黑暗交替培養(yǎng)選擇性過濾梯度離心法硝酸纖維素濾膜法硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長的方法由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長。通過物理學方法從隨機的、不同步細菌群體中選擇出同步的菌體二、單細胞微生物的典型生長曲線生長曲線(GrowthCurve)：把少量純種單細胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的溫度、通氣（厭氧菌則不能通氣）等條件下，它們的群體就會有規(guī)律的生長起來，以細胞數(shù)目的對數(shù)值做縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，就可以畫出一條有規(guī)律的曲線，這就是微生物的生長曲線。二、典型生長曲線細菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標作圖一條典型的生長曲線至少可以分為：遲緩期，對數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時的分裂代數(shù)（R）的不同。二、典型生長曲線又稱停滯期、調(diào)整期或適應期。指少量微生物接種到新培養(yǎng)基中后，在開始培養(yǎng)的一段時間內(nèi)細胞數(shù)目不增加的時期。（一）延滯期（lagphase）生長速率常數(shù)等于零。細胞形態(tài)變大或增長例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于延滯期的細菌細胞體積最大。細胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈噬堿性。合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶。對外界不良條件反應敏感（如：溫度、NaCl溶液濃度、抗生素等）。（一）延滯期（lagphase）延滯期特點：影響延滯期長短的因素很多，除菌種外，主要有三個。接種齡接種量培養(yǎng)基成分延滯期出現(xiàn)的原因：調(diào)整代謝，合成新的酶系和中間代謝產(chǎn)物以適應新環(huán)境。

如何縮短延滯期？在生產(chǎn)實踐中縮短延滯期的常用手段：(1)通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短；(2)利用對數(shù)生長期的細胞作為種子；(3)盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；(4)適當擴大接種量；（二）指數(shù)期（exponentialphase）又稱對數(shù)期（logarithmicphase），是指在生長曲線中，緊接著延滯期的一個細胞以幾何級數(shù)速度分裂的一段時期。生長速率常數(shù)R最大，因而細胞每分裂一次所需的代時或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時間最短。細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)各種成分最為均勻。酶系活躍，代謝旺盛。細菌數(shù)目增加與原生質(zhì)總量增加，與菌液濁度增加呈正相關(guān)性

指數(shù)期特點：指數(shù)生長可以用下式表示：

Bt=B0×2nn可通過上式計算得出，將等式兩側(cè)取對數(shù)重排后得：lgBt=lgB0+nlg2

lg

Bt-lg

B0

lgBt-lg

B0

lg20.301式中：B0

為起始師細胞數(shù)目，Bt

為指數(shù)生長某個時刻t時的細胞數(shù)目，

n為世代數(shù)n==Bt0（1）繁殖代數(shù)（n）（2）生長速率常數(shù)（R）（3）代時（G）n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————

t2–t1t2–t1

lgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）

lg21t2–t1G=————=————————————————=R3.322（lgx2–lgx1）

t2-t1n在指數(shù)生長期中，有三個參數(shù)最為重要：在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)，在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doublingtime)。代時通常以G表示。例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B0），經(jīng)4h（t）后增加到49，000，000（Bt），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12借助于n和t，還可以計算出不同培養(yǎng)條件下的代時G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時為20分鐘。在4小時內(nèi)共繁殖了12代。代時能夠反應細菌的生長速率，代時短，生長速率快，代時長，生長速率慢。在很多微生物學研究中常常要了解微生物的代時。代時在不同種微生物中的變化很大，另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的長短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時是恒定的，因此它是微生物菌種的一個重要特征。影響指數(shù)期微生物代時時間的因素很多，主要有：（1）菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；多數(shù)微生物的代時為1~3h,然而有些快速生長的微生物的代時還不到10min,而另一些微生物的代時卻可長達幾小時或幾天；一些細菌的代時菌名 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 代時E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細菌） 肉湯或牛奶37 16~18 E.aerogenes 組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉湯 37 48Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 1200溫度對微生物的代時有明顯影響：E.Coli在不同溫度下的代時溫度（℃） 代時（分） 溫度（℃） 代時（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77（2）培養(yǎng)溫度：（3）營養(yǎng)成分：同一種細菌，在營養(yǎng)屋豐富的培養(yǎng)基中生長，其代時較短，反之較長；（4）營養(yǎng)物濃度：在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率的營養(yǎng)物成分，就稱為生長限制因子（growyh-limitedfactor）。指數(shù)期的微生物因其整個群體的生理特性較一致、細胞成分平衡發(fā)展和生長速率恒定，故可作為代謝、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌體的最適宿主菌齡，也是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡。（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱恒定期或最高生長期。此時培養(yǎng)液中活細菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細菌生長，導致生長速率常數(shù)降低直至零(即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中)。細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段：細胞開始貯存糖原、異染顆粒和脂肪等貯藏物；多數(shù)芽孢桿菌在這時開始形成芽孢；有的微生物在穩(wěn)定期時還開始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期特點：穩(wěn)定期來到的原因主要是：1、營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；2、營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C/N比值不合適等；3、酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的積累；4、pH、氧化還原勢等物化條件越來越不適宜，等等；生產(chǎn)上常通過補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度、對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩等措施延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝物為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)的最佳收獲期。（四）衰亡期（decline或death

phase）在衰亡期，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率超過新生速率，整個群體呈現(xiàn)出負增長。細胞形態(tài)多樣，例如會產(chǎn)生很多膨脹、不規(guī)則的退化形態(tài)；有的微生物因蛋白水解酶活力的增加就發(fā)生自溶；有的微生物在這時產(chǎn)生或釋放對人類有用的抗生素等次生代謝產(chǎn)物；在芽孢桿菌中，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時期；產(chǎn)生衰亡期的主要原因是外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，從而引起細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體死亡。lg細胞數(shù)或產(chǎn)物濃度時間細胞產(chǎn)物I型 II型微生物生長與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過程與微生物細胞生長的過程并不總是一致的。一般認為：初級代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過程，初級代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細胞的形成過程同步，微生物生長的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時機；次級代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長和繁殖無關(guān)。次級代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細胞的形成過程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長穩(wěn)定期的后期或衰亡期。絲狀微生物的群體生長絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。以菌絲干重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。培養(yǎng)時間與菌絲體干重的立方根成直線關(guān)系。可分為三個階段：1、停滯期（生長延滯期）2、迅速生長期（快速生長期）3、衰亡期（生長衰退期）三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）又稱開放培養(yǎng)（openculture），在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)是在研究生長曲線的基礎上，通過認識穩(wěn)定期到來的原因，并采取有效措施而實現(xiàn)的。一方面，以一定速度連續(xù)流進新鮮培養(yǎng)基，并立即攪拌均勻。另一方面，利用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物。動態(tài)平衡培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)（一）連續(xù)培養(yǎng)原理連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細胞狀態(tài)分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細胞連續(xù)培養(yǎng)器實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐（二）連續(xù)培養(yǎng)器（三）連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)1、恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持微生物始終在低于其最高生長速率的條件下達到連續(xù)培養(yǎng)。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。特點：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應用范圍：實驗室科學研究恒化器（Chemostat或bactogen）概念：根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體高密度、生長速度恒定的微生物細胞。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌液濃度不變,即濁度不變。當濁度高時，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復雜，煩瑣。2、恒濁培養(yǎng)使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。恒濁器與恒化器的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制實質(zhì)因子不恒定最高速率大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制實質(zhì)因子恒定低于最高速率不同生長速率的菌體實驗室為主（四）連續(xù)發(fā)酵（continuousfermentation）將連續(xù)培養(yǎng)用于發(fā)酵，即為連續(xù)發(fā)酵。相對于單批發(fā)酵而言。SCP的生產(chǎn)、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的發(fā)酵、石油脫蠟、污水處理等應用。優(yōu)點：高效，簡化了操作裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作；自控：便于利用各種儀表進行自動控制；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；節(jié)約大量動力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負荷均衡合理。缺點：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時間受以上因素限制，一般只能維持數(shù)月~1年。指微生物在液體培養(yǎng)基中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)。選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量補料（采用逐量流加的方式進行）提高溶解氧的濃度防止有害代謝產(chǎn)物的生成四、微生物的高密度培養(yǎng)（高密度發(fā)酵）高密度培養(yǎng)的具體方法：應用：用基因工程菌生產(chǎn)多肽類貴重藥物（胰島素、白細胞介素、干擾素、生長激素等）。目前被用于高密度培養(yǎng)的只有大腸桿菌和釀酒酵母不同菌種和同種不同菌株間，達到高密度的水平差別很大。E.coli可達174~175g(濕重)/L，理論值可達200g/L，甚至400g/L

。第三節(jié)影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的外界因素很多,除了營養(yǎng)條件外,還有許多物理條件。如溫度、pH、氧氣等。一、溫度由于微生物的生命活動是由一系列生物化學反應組成的，而這些反應受溫度的影響極為明顯。溫度是影響微生物生長的最重要的因素之一最低生長溫度最適生長溫度最高生長溫度不同微生物生長的溫度范圍在-12—100oC，每種微生物生長的溫度都存在生長溫度三基點。最適生長溫度有時也簡稱“最適溫度”，其意義是某菌分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度。（一）生長溫度三基點

菌名 生長溫度 發(fā)酵溫度 累積產(chǎn)物溫度 （℃） （℃） （℃）

Streptococcusthermophilus 37 47 37S.lactis 34 40 產(chǎn)細胞：25~30 產(chǎn)乳酸：30Streptomycesgriseus 37 28 _Corenybacteriumpekinense 32 33~35 _Clostridiumacetobutylicum 37 33 _Peniciliumchrysogenum 30 25 20以青霉素的生產(chǎn)為例：培養(yǎng)165小時采用分段控制溫度的方法，其青霉素產(chǎn)量比始終在30℃培養(yǎng)提高了14.7%。分段控制方式：0~5小時，30℃；5~40小時，25℃；40~125小時，20℃；125~165小時，25℃?！锊煌砩^程的最適溫度微生物不同生理活動要求不同溫度最適生長溫度≠發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：（二）微生物生長溫度類型低溫型微生物（嗜冷微生物）：＜20℃（一般為15℃）。

中溫型微生物（嗜溫微生物）：20～45℃，室溫菌約25℃，體溫菌約37℃。高溫型微生物（嗜熱微生物）：＞45℃，一般50～60℃。

最低溫度最適溫度最高溫度嗜熱液化芽孢桿菌376070嗜熱纖維芽孢桿菌506068丙酮丁醇梭菌203747植物乳桿菌103040干酪乳桿菌103040大腸桿菌103747乳脂鏈球菌103037嗜熱鏈球菌2040~5053枯草桿菌1530~3755黑曲霉730~3947啤酒酵母1028401、高溫對微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。微生物對熱的耐受力與以下因素有關(guān):（1）微生物種類及發(fā)育階段嗜熱菌、有芽孢、繁殖結(jié)構(gòu)、老齡菌抗熱（二）高溫與低溫對微生物的影響（2）微生物對熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響

培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時、pH適宜時、含水量小時、含菌量高、熱處理時間短，微生物不易死亡。

當環(huán)境溫度低于微生物的最適生長溫度時，微生物的生長繁殖停止，當微生物的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時，不會很快造成死亡并能在較長時間內(nèi)保持活力，當溫度提高時，可以恢復正常的生命活動。低溫保藏菌種就是利用這個原理。一些細菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通?？梢蚤L時間地保藏在4℃的冰箱中。當溫度過低，造成微生物細胞凍結(jié)時，有的微生物會死亡，有些則并不死亡。2、低溫對微生物的影響造成死亡的原因：①凍結(jié)時細胞水分變成冰晶，冰晶對細胞膜產(chǎn)生機械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。②凍結(jié)過程造成細胞脫水。凍結(jié)速度對冰晶形成有很大影響，緩慢凍結(jié)，形成的冰晶大，對細胞損傷大；快速凍結(jié)，形成的冰晶小、分布均勻，對細胞的損傷小，因此，利用快速凍結(jié)可以對一些菌種進行凍結(jié)保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護劑等可對菌種進行長期保藏。氧對微生物的生命活動有著極其重要的影響，微生物對氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群:專性好氧菌好氧菌微好氧菌兼性厭氧菌耐氧厭氧菌厭氧菌(專性)厭氧菌二、氧氣對微生物生長的影響五類與氧關(guān)系不同的微生物在半固體瓊脂柱中的生長狀態(tài)（模式圖）氧濃度對不同微生物生長的影響厭氧菌的氧毒害機制——SOD學說：厭氧菌因缺乏超氧化物歧化酶，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧物陰離子自由基而毒害致死。產(chǎn)甲烷菌等都屬于厭氧菌厭氧性微生物，在培養(yǎng)時必須隔絕空氣，通常采取的措施有：用焦性沒食子酸吸收氧氣、抽真空、加蓋覆物以及密閉容器等，或采用厭氧培養(yǎng)箱、發(fā)酵罐等。 H2O+1/2O22O-2·+2H+ O2+H2O2 2H2OSOD好氧生物和耐氧細菌過氧化氫酶好氧生物過氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌各類菌所含對氧解毒酶

專性好氧菌SOD，過氧化氫酶兼性厭氧菌SOD，過氧化氫酶專性厭氧菌二種酶均無微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，過氧化物酶◆影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力?！舾淖兠富?、酶促反應的速率及代謝途徑：如：酵母菌在pH4.5～5產(chǎn)乙醇，在pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸。◆環(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。三、pH值對微生物生長影響（一）環(huán)境pH值對微生物生長的影響微生物的生長pH值范圍極廣，從pH<2~>10都有微生物能生長。但是絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0~9.0之間。微生物生長的pH值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過最高生長pH值時，微生物生長受抑制或?qū)е滤劳?。（?不同微生物對pH要求不同不同的微生物最適生長的pH值不同，根據(jù)微生物生長的最適pH值，將微生物分為：

嗜堿微生物：硝化細菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌耐堿微生物：許多鏈霉菌中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫桿菌屬耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌微生物種類最低pH最適pH最高pH大腸桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌黑曲霉一般放線菌一般酵母菌

1.55.03.06.0—8.06.0—7.57.0—7.55.0—6.07.0—8.05.0—6.09.0108.0

一些常見微生物生長的pH值范圍同一種微生物在不同的生長階段和不同生理生化過程中，對環(huán)境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌

在pH值=5.5—7.0時，以菌體生長為主在pH值=4.3—5.3時，進行丙酮丁醇發(fā)酵同一種微生物由于環(huán)境pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。例如：黑曲霉pH值=2～3時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH值在7左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。

幾種抗生素產(chǎn)生菌的生長與發(fā)酵的最適pH

微生物 生長最適pH 合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3紅霉素鏈霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3產(chǎn)黃青霉 6.5~7.2 6.2~6.8金霉素鏈霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3龜裂鏈霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1灰黃青霉 6.4~7.0 6.2~6.5（三）微生物細胞內(nèi)的pH值雖然微生物生活的環(huán)境pH值范圍較寬，但是其細胞內(nèi)的pH值卻相當穩(wěn)定，一般都接近中性。這種維持細胞內(nèi)穩(wěn)定中性pH值的特性能夠保持細胞內(nèi)各種生物活性分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細胞內(nèi)酶所需要的最適pH值。微生物胞內(nèi)酶的最適pH值一般為中性，胞外酶的最適pH值接近環(huán)境pH值。（四）微生物的生命活動對環(huán)境pH值的影響微生物在生長過程中也會使外界環(huán)境的pH值發(fā)生改變，原因：由于有機物分解：分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值下降；分解蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值上升由于無機鹽選擇性吸收：銨鹽吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH↓硝酸鹽吸收(NaNO3NaOH)，pH↑★培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值的措施過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。NH4+被吸收NO3+被吸收★配制培養(yǎng)基時調(diào)整pH值的措施第五節(jié)有害微生物的控制在周圍環(huán)境中，到處都有各種各樣的微生物存在著，其中是對人類有害的微生物，我們應采取有效的措施來抑制或消滅它們。物理方法包括高溫、干燥、輻射、過濾等；化學方法包括消毒劑、防腐劑和化學治療劑。滅菌（sterilization）采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。滅菌還可分殺菌（菌體雖死、形體尚存）、溶菌（菌體被殺死后，細胞自溶、裂解消失）。

消毒（disinfection）采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對人體有害的病原菌，而對被處理物體基本無害的措施，稱為消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐?；煟╟hemotheraphy）即化學治療。利用具有高度選擇毒力的化學物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病院微生物的生長繁殖，以達到治療該傳染病的一種措施。一、幾個基本概念低溫：利用4℃以下的各種低溫以保藏食物、藥品、菌種等。缺氧：在密閉容器中加入除氧劑，如鐵粉。真空保藏也是比較常用的方法。干燥：采用曬干或紅外線干燥保藏糧食、食品等，或在密封條件下用吸濕劑也可達到防霉作用。高滲：通過鹽漬或糖漬達到高滲。高酸度：如泡菜、酸菜等。高醇度：用酒保存食品。防腐劑：苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸等。防腐的措施二、常用的滅菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法1、高溫滅菌（消毒）法：是最常用的物理方法。高溫可引起蛋白質(zhì)、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導致微生物死亡。

（一）溫度能作為物理殺菌因素的種類很多，例如高溫、輻射、超聲波和激光等，現(xiàn)在最常用的方法是高溫。當溫度超過微生物生長的最高溫度或低于生長的最低溫度都會對微生物產(chǎn)生殺滅作用或抑制作用(1)干熱滅菌法（dryheatsterilization）①焚燒法或火焰灼燒法（incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質(zhì)碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用于無經(jīng)濟價值的物品滅菌，及不怕燒的實驗器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。②干燥熱空氣滅菌法(hot-airoven)：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至160℃—180℃，維持1—2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。特點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。(2)濕熱法(moistheatsterilization)：特點：溫度低、時間短、滅菌效果高原因：1)菌體內(nèi)含水量越高，則凝固溫度越低；2)蒸汽冷凝會放出潛熱；3)飽和水蒸汽穿透力強；4)濕熱易破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的穩(wěn)定

性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。

濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：多數(shù)細菌和真菌的營養(yǎng)細胞：在60℃左右處理5~10分鐘；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上溫度處理；細菌的芽孢：121℃處理15分鐘以上；①高壓蒸汽滅菌法利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。應根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121℃。葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用112℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。注意事項：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。高壓蒸汽滅菌鍋利用溫度進行殺菌的定量指標熱死時間：在某一溫度下，殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最短時間。如：E.coli在60℃下為10min。熱死溫度（熱死點）：在一定時間內(nèi)（一般為10min），殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最低溫度。多數(shù)細菌、酵母菌、霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒，在50～65℃10min即可致死。梅毒密螺旋體43℃10min即可致死。高溫對培養(yǎng)基的影響及其防止措施高溫對培養(yǎng)基的不利影響：▲會產(chǎn)生混濁或形成不溶性沉淀▲營養(yǎng)成分被破壞（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；▲色澤加深（褐變?nèi)绠a(chǎn)生氨基糖等）；▲改變培養(yǎng)基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物質(zhì)，抑制微生物生長；消除有害影響的措施

采用特殊的加熱滅菌法過濾除菌法加入螯合劑影響加壓蒸氣滅菌效果的因素

1、滅菌物體的含菌量2、滅菌鍋內(nèi)排除空氣的程度3、滅菌對象的pH值pH＜6.0時，微生物易死亡；pH6.0~8.0時，不易死亡。4、滅菌對象的體積5、加熱與散熱速度②煮沸消毒法將水加熱至100℃，煮沸15min—30min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢，達到消毒物的目的。一般用于引用水的消毒。③巴斯德消毒法（Pasteurization）：用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養(yǎng)風味，又進行了消毒該法一般是將待消毒的液體食品置于62℃處理30min，然后迅速冷卻。即可達到消毒目的。適用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法。引起環(huán)境中大多數(shù)污染菌死亡的溫度都在60℃以內(nèi)，所以為了不影響食品的營養(yǎng)和風味，多采用在較低的致死溫度下，稍長于致死時間的消毒方法。低溫長時法(Lowtemperaturelongtime,LTLT)；

62.9℃30min處理牛奶高溫瞬時（Hightemperatureshorttime,HTST):71.6℃15s處理牛奶超高溫巴斯德滅菌法(Ultrapasteurization):讓液體食品停留在140℃左右3-4s，急劇冷卻至75℃，經(jīng)勻質(zhì)化后冷卻至20℃。④間歇滅菌法(丁達爾滅菌法)：將待滅菌物品在80

-100℃蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28

-37℃）下過夜，并重復以上過程三遍以上。適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、藥品的滅菌。缺點是麻煩、費時。低溫——低溫是通過降低酶反應速度使微生物生長受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌種放置冷藏箱中可保存數(shù)周至數(shù)月而不衰竭死亡；食品保鮮冷凍法：食品工業(yè)中采用-10℃左右的冷凍溫度較長時間地保藏食品；冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷凍保存。2、低溫抑菌對一種微生物來說：超過它的最高生長溫度可殺死它采用它的最適生長溫度可培養(yǎng)它低于它的最低生長溫度可保存它采用濾孔比細菌還小的篩子或濾膜作成各種過濾器，當空氣或液體流經(jīng)篩子或濾膜時，微生物不能通過濾孔而被阻留在一側(cè)，從而達到滅菌的目的。但不能除去病毒。實驗室中常用的濾器：濾膜過濾器、蔡氏過濾器、玻璃過濾器、磁土過濾器等過濾介質(zhì)：醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜；以及石棉板、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)玻璃等。濾器孔徑：常用0.22μm、0.45

μm

。應用：對于含酶、血清、維生素和氨基酸等熱敏物質(zhì)除菌。（二）過濾除菌法不耐熱的液體培養(yǎng)基的滅菌干燥缺水的環(huán)境會抑制微生物的生長，甚至導致微生物的死亡.一般微生物的營養(yǎng)體對干燥敏感，但芽胞或霉菌、放線菌的孢子較耐干燥，所以通常用沙土管法來保存有孢子的菌種，真空凍干法可保存細菌、病毒、立克次氏體等，干燥法還可保存食品。滲透壓：低滲溶液一般對菌體影響不大，但對原生質(zhì)體可造成破壞；高滲溶液則能抑制大多數(shù)微生物的生長（耐滲性微生物除外）。所以通常用鹽或糖加工蔬菜、肉類和水果等。相同含量的鹽、糖、蛋白質(zhì)所形成的溶液滲透壓為:鹽>糖>蛋白質(zhì)對于一般微生物來說，在含鹽5%~30%或含糖30%~80%的高滲條件下可抑制或殺死某些微生物。(三)干燥和滲透壓細菌中的嗜鹽菌：能在15%~30%的鹽溶液中生長，主要分布在鹽湖、死海、海水和鹽場及腌漬菜中。又分為：低嗜鹽菌：能在2%~5%鹽溶液中生長中嗜鹽菌：5%~20%極端嗜鹽菌：20%~30%高糖環(huán)境下生長的微生物：

花蜜酵母菌和某些霉菌能在60%~80%的糖溶液中生長產(chǎn)甘油的耐高滲酵母能在20%~40%的糖蜜中生長輻射：是能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。與微生物有關(guān)的輻射：電磁輻射：可見光、紫外光，電離輻射：χ、γ、β射線。(四）輻射1、可見光：波長在400—800nm的電磁輻射為可見光。大部分微生物不需要光，少數(shù)菌需要光作為能源。一般來講，可見光對大多數(shù)化能微生物沒有影響，但是，太強或連續(xù)長時間照射也會導致微生物死亡（光氧化作用）。2、紫外線（ＵＶ）波長在100—400nm的電磁輻射為紫外線。紫外線殺菌或誘變原理：紫外線作用于DNA

，使其產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體，引起DNA結(jié)構(gòu)變形，阻礙正常的堿基配對，從而造成微生物變異或死亡。紫外線會使空氣中的分子氧變成臭氧，臭氧釋放的原子氧有殺菌作用。其中波長在260—280nm處的紫外線殺菌力最強。主要因為核酸（DNA、RNA）的吸收峰為260nm，蛋白質(zhì)的吸收峰為280nm。光復活現(xiàn)象：經(jīng)紫外線照射的微生物，在可見光下，光可以激活DNA修復酶，該酶能修復DNA上的損傷，使微生物的突變率或死亡率下降。微生物對紫外線的抵抗力與以下因素有關(guān)：照射時間：照射時間長，死亡率高。照射強度：照射強度大，死亡率高。微生物種類及生長階段：革蘭氏陽性菌比陰性菌抗性強；多倍體比單倍體抗性強；孢子和芽孢比營養(yǎng)細胞抗性強；干燥細胞比濕潤細胞抗性強。應用：由于穿透力差，只適用于物體表面以及空氣、水的消毒殺菌，也用于誘變育種。

χ、γ、β射線，波長短，能量高，有較強的殺傷力。作用原理：可引起水和其他物質(zhì)的電離，產(chǎn)生游離基，使核酸、蛋白質(zhì)或酶發(fā)生變化，造成細胞損傷或死亡。特點：穿透力強，非專一性，作用于一切細胞成分，對所有生物均有殺傷作用。應用：用于殺菌或菌種誘變。一般低劑量的電離輻射（如500倫琴），可以促進微生物的生長，或誘發(fā)變異，高劑量（如10萬倫琴）則可引起微生物的死亡。r射線是由60Co發(fā)出的高新輻射，電離作用和穿透力都很強，常用于食品滅菌。3、電離輻射微波：微波的范圍在915—2450MHz/s之間。機理：微波產(chǎn)生熱效應，使蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)變性，導致微生物死亡。

特點：加熱均勻，熱能利用率高、加熱時間短。應用：食品消毒、滅菌。（五）微波與超聲波超聲波：每秒鐘振動在1600以上的聲波。機理：引起膜破壞，細胞破裂，內(nèi)涵物逸出。

應用：破碎細胞，提取胞內(nèi)物質(zhì)（代謝產(chǎn)物、酶等）殺菌,超聲波殺菌效力大小與頻率、強度、處理時間等多種因素有關(guān)。三、常用的化學抑菌方法消毒劑:可以抑制或殺滅微生物，但對人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學試劑.—主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物。防腐劑:可以抑制或阻止微生物生長，但對人體或動物體的毒性較低的化學藥劑.——用于肌體表面，如皮膚、粘膜、傷口等處防止感染，也有的用于食品、飲料藥品的防腐作用。☆但現(xiàn)時消毒劑和防腐劑間的界限已并不很嚴格.（一）消毒劑和防腐劑1、消毒防腐劑的作用機理一般有下列三種方式:①使微生物蛋白質(zhì)凝固變性,發(fā)生沉淀.如酒精等.②破壞菌體的酶系統(tǒng),影響菌體代謝.如過氧化氫等.③降低微生物表面張力,增加細胞膜的通透性,使細胞發(fā)生破裂或溶解.如來蘇兒等酚類物質(zhì).2、消毒劑殺菌的規(guī)律

低濃度時，會對微生物的生命活動起刺激作用，隨濃度的增加，相繼出現(xiàn)抑菌和殺菌作用，因而形成一個連續(xù)的作用譜。3、表面消毒劑的相對殺菌強度——石炭酸系數(shù)（P.C.）在一定時間內(nèi)，被試藥劑殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效的石炭酸最高稀釋度之比。時間：10min、供試菌：Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）

如：P.C.=300/100=3類型名稱及使用方法作用原理應用范圍醇類70%—75%乙醇脫水、蛋白質(zhì)變性皮膚、器皿醛類0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白質(zhì)變性房間、物品消毒（不適合食品廠）酚類3%—5%石炭酸2%來蘇兒3%—5%來蘇兒破壞細胞膜、蛋白質(zhì)變性地面、器具皮膚地面、器具氧化劑0.1%高錳酸鉀3%過氧化氫0.2%—0.5%過氧乙酸氧化蛋白質(zhì)活性基團，酶失活皮膚、水果、蔬菜皮膚、物品表面水果、蔬菜、塑料等4、常用的消毒防腐劑及其應用類型名稱及使用方法作用原理應用范圍重金屬鹽類0.05%—0.1%升汞2%紅汞0.1%—1%硝酸銀0.1%—0.5%硫酸銅蛋白質(zhì)變性、酶失活變性