第14章核酸的物化性質(zhì)

第14章核酸的物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復(fù)性及雜交一、核酸的水解（一）酸水解對(duì)酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵

嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵脫嘌呤：

pH1.6，37℃，對(duì)水透析

pH2.8，100℃，1h脫嘧啶：

98-100%甲酸，175℃，2h

三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或

80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的堿基組成2（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對(duì)堿敏感室溫，0.3～1mol/LKOH，18-24h，可將RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。DNA抗堿水解生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。3（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸特異的磷酸二酯酶：核酸酶N-糖苷酶4核酸酶的分類底物專一性：核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內(nèi)切酶(endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸二酯鍵的斷裂方式：5′-（寡）核苷酸3′-（寡）核苷酸

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核酸酶（nuclease）ATCGTCCCGGTAGA化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)5′3′外切酶內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶具有序列特異性的核酸酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶6二、核酸的酸堿性質(zhì)磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。DNA等電點(diǎn)4～4.5RNA等電點(diǎn)2～2.5兩性電解質(zhì)：酸性的磷酸基和堿性的堿基

電泳和離子交換分離純化核酸7三、核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收。λmax=260nm8鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。含量計(jì)算1ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）

或：20ug/mL寡核苷酸判斷DNA是否變性在DNA的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應(yīng)）在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）9四、核酸的變性、復(fù)性及雜交(一)變性(denaturation)核酸變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。102202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值123變性因素：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

變性后的理化性質(zhì)：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。11DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱為解鏈溫度（meltingtemperature,Tm）。12影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性。②G-C含量與Tm值成正比測(cè)定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.4413③介質(zhì)中離子強(qiáng)度

離子強(qiáng)度高，Tm高。14（二）復(fù)性(renaturation)

變性的DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的DNA單鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。15（三）核酸分子雜交(Hybridization)16不同來(lái)源的DNA單鏈間或單鏈DNA與RNA之間只要有堿基配對(duì)的區(qū)域，在復(fù)性時(shí)可形成局部雙螺旋區(qū)，稱核酸分子雜交（hybridization）。制備特定的探針（probe）通過(guò)雜交技術(shù)可進(jìn)行基因的檢測(cè)和定位研究。175’3’5’3’5’3’5’3’提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳、堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA雜交放射自顯影Southernblotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。Southern印跡法

19NorthernBlotting研究對(duì)象是mRNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）。WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究對(duì)象是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體。20基因芯片21小結(jié)

核酸