電泳法和高效毛細管電泳法

第10章電泳法和高效毛細管電泳法

(ElectrophoresisandHighPerformanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅動下，在毛細管中按其淌度或分配系數(shù)不同進行高效、快速分離的電泳新技術，也稱為高效毛細管電泳。20世紀30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術獲得1948年諾貝爾化學獎

1981,實驗上和理論上為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。

毛細管電泳的原理

1裝置

毛細管數(shù)據(jù)處理電極檢測器電極試樣緩沖液緩沖液

高壓電源

（可高至30KV）

第10章電泳法和高效毛細管電

分離模式1毛細管區(qū)帶電泳2膠束電動毛細管色譜3毛細管凝膠電泳

4親和毛細管電泳5毛細管電色譜6毛細管等電聚焦電泳7毛細管等速電泳第10章毛細管電泳分離模式

1毛細管區(qū)帶電泳（CZE）

也稱為毛細管自由溶液區(qū)帶電泳毛細管電泳中最基本的操作模式，應用最廣泛，是其它各種操作模式的母體

第10章毛細管電泳分離模式

2膠束電動毛細管色譜膠束電動毛細管色譜:是以電滲流驅動的一種色譜技術膠束電動毛細管色譜MECC:是以膠束為假固定相的一種電動色譜，是電泳技術和色譜技術的結合加入高于膠束臨界濃度的表面活性劑膠束電動色譜的應用特點:使毛細管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMECC可達到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MECC分離時間通常小于30min，但達到相仿效率的毛細管LC，需要更長的時間。

第10章毛細管電泳

分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

3毛細管凝膠電泳CGE

是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質，網(wǎng)狀結構，按分子的大小分離

毛細管凝膠電泳的特點：綜合了電泳技術和平板凝膠電泳的優(yōu)點，電泳峰尖銳，柱效極高短柱上實現(xiàn)極好的分離試樣容量為10－12g主要缺點:制備柱較困難，壽命較短

已成為分離分析生物大分子如蛋白質、多肽、核酸、DNA等強有力的工具。例應用CGE分離與激光誘導熒光檢測相結合，用于DNA序列快速分析。第10章毛細管電泳分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

5毛細管電色譜CEC:以電滲流驅動流動相，開管和填充兩種，通常填充或涂布固定相比高效液相色譜具有更高的柱效

第10章毛細管電泳分離模式

6毛細管等電聚焦CIEF:建立在不同蛋白質或多肽之間等電點（pI值）差異基礎上的分離方法，通過建立pH值梯度。蛋白質的等電點(pI):指蛋白質分子的表觀電荷數(shù)為零時的pH值。

進樣－等電聚焦－檢測先將脫鹽的試樣（蛋白質）以≥1％的濃度與兩性電解質溶液混合，用壓力進樣充入毛細管柱(陽極端)，置于陽極電解質溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質如NaOH中。施加電壓，進行電泳實驗。兩性電解質離子形成pH的位置梯度，而蛋白質在遷移時會在其等電點的pH區(qū)域內(nèi)停止移動。這樣pI不同的蛋白質各組分會在毛細管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCl或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質得到分離。第10章毛細管電泳分離模式

毛細管等電聚焦的實驗方法:

毛細管等電聚焦特點:等電聚焦實際上也是一個試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點相差0.01pH的兩種蛋白質.注意:電滲流的存在會破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

第10章毛細管電泳分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

7毛細管等速電泳分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進樣前后分別使用前導電解質溶液和終結(后繼）電解質溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過檢測窗口。等速電泳所要求的條件:

1.特殊的電解質系統(tǒng):

在毛細管等速電泳中,用有效淌度比樣品中任何離子的有效淌度都大,并具有一定緩沖能力的離子作為前導電解質(leadingelectrolyte),加入到末端(檢測端)電解槽和毛細管中,用有效淌度比樣品中任何離子的有效淌度都小,并具有一定緩沖能力的離子作為尾隨電解質(terminatingelectrolyte)

加入起始端電解槽中.樣品加在前導電解質和尾隨電解質之間.系統(tǒng)中要加入對離子,以滿足電中性的要求.區(qū)帶電泳和等速電泳使用的電解質溶液的不同在區(qū)帶電泳中，整個系統(tǒng)都用同一種電解質充滿，這種電解質被稱為背景電解質或支持電解質。它運載電流并有一定的緩沖能力。在等速電泳中，不加入這樣的背景電解質。

2.背景電流要小到足以克服區(qū)帶電泳效應

在毛細管等速電泳中,由于沒有一個背景電解質支持電流(毛細管等速電泳要求溶劑的自身電導可以忽略不計),各區(qū)帶互相連接.

毛細管等速電泳一般用恒流操作模式.

分離開始后,在電壓的作用下,各組分由于淌度的不同被分離.

系統(tǒng)通電后,樣品中遷移速度最大的離子運動最快,但慢于前導電解質.遷移速度最小的離子運動最慢,但快于尾隨電解質,具有不同淌度的離子得到分離。

恒穩(wěn)態(tài)時所有區(qū)帶具有相同的移動速度.第10章毛細管電泳

10.2.3理論效率及表示方法

1.理論塔板高

H=L/N

N=5.54(tR/W?)2實驗上可按上式求出理論塔板數(shù)W?為電泳峰的半峰寬

2.分離度（Rs），1毛細管電泳系統(tǒng)：高壓電源（可高至30KV）毛細管數(shù)據(jù)處理檢測器電極電極緩沖液試樣緩沖液基本結構：高壓電源、電解液槽和進樣系統(tǒng)、毛細管及恒溫裝置、檢測器、數(shù)據(jù)處理裝置10.3電泳儀和高效毛細管電泳儀⑴高壓電源:0-30kv連續(xù)可調的直流高壓電源

⑵毛細管柱：內(nèi)徑25-75μm,常用50和75μm

材料：石英為主，長度30-70cm,

凝膠柱20cm左右?；窘Y構：（3）進樣方法Ⅰ電動力學進樣也稱電遷移進樣.樣品方法:將毛細管的進樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測端的緩沖液間施加進樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進入毛細管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進行。電極電極樣品壓力樣品真空樣品虹吸Ⅱ流體動力學進樣A進樣端加壓B檢測端出口減壓C虹吸進樣流體動力學進樣優(yōu)點：1.若嚴格控制樣品的黏度和溫度，則進入毛細管的量是固定的；2.在進樣中沒有進樣歧視。ABC(4)檢測器檢測器檢出限（mol/L）特點UV－可見吸收10-5－10-6

近似通用，常規(guī)應用熒光非相干光誘導10-7－10-8

靈敏，但試樣通常要衍生激光誘導10-10－10-12

高靈敏度，價格貴，要衍生化電化學

電導10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

選擇性，靈敏度高，微量質譜10-7－10-9

儀器復雜，可獲結構信息，質量靈敏度高放射10-9－10-11

靈敏度高，操作有特殊要求(4)檢測器檢測器檢出限（mol/L）特點UV－可見吸收10-5－10-6

近似通用，常規(guī)應用熒光非相干光誘導10-7－10-8

靈敏，但試樣通常要衍生激光誘導10-10－10-12

高靈敏度，價格貴，要衍生化電化學

電導10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

選擇性，靈敏度高，微量質譜10-7－10-9

儀器復雜，可獲結構信息，質量靈敏度高放射10-9－10-11

靈敏度高，操作