GB/T 17999.10-2008SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第10部分：SPF雞間接免疫熒光試驗(yàn)

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜１７９９９．１０—２００８

代替ＧＢ／Ｔ１７９９９．９—１９９９

犛犘犉雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

第１０部分：犛犘犉雞間接免疫熒光試驗(yàn)

犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀—犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲—

犘犪狉狋１０：犐狀犱犻狉犲犮狋犻犿犿狌狀狅犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犪狊狊犪狔犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀

２００８１２３１發(fā)布２００９０５０１實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

書

犌犅／犜１７９９９．１０—２００８

前言

ＧＢ／Ｔ１７９９９《ＳＰＦ雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)》分為１０個(gè)部分：

———第１部分：ＳＰＦ雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)總則；

———第２部分：ＳＰＦ雞紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)；

———第３部分：ＳＰＦ雞血清中和試驗(yàn)；

———第４部分：ＳＰＦ雞血清平板凝集試驗(yàn)；

———第５部分：ＳＰＦ雞瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)；

———第６部分：ＳＰＦ雞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；

———第７部分：ＳＰＦ雞胚敏感試驗(yàn)；

———第８部分：ＳＰＦ雞雞白痢沙門氏菌檢驗(yàn)；

———第９部分：ＳＰＦ雞試管凝集試驗(yàn)；

———第１０部分：ＳＰＦ雞間接免疫熒光試驗(yàn)。

本部分為ＧＢ／Ｔ１７９９９的第１０部分。

本部分代替ＧＢ／Ｔ１７９９９．９—１９９９《ＳＰＦ雞間接免疫熒光試驗(yàn)》。

本部分與ＧＢ／Ｔ１７９９９．９—１９９９相比主要變化如下：

———增加了規(guī)范性附錄Ａ“試劑的配制”和資料性附錄Ｂ“細(xì)胞計(jì)數(shù)方法”；

———詳細(xì)界定了試驗(yàn)成立條件和待檢樣品的判定標(biāo)準(zhǔn)。

本部分的附錄Ａ為規(guī)范性附錄，附錄Ｂ為資料性附錄。

本部分由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。

本部分由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（ＳＡＣ／ＴＣ１８１）歸口。

本部分起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、濟(jì)南斯帕法

斯家禽有限公司。

本部分主要起草人：曲連東、劉家森、韓凌霞、邵衛(wèi)星、朱果、單忠芳、姜騫、司昌德、于海波、孟慶文。

本部分所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

———ＧＢ／Ｔ１７９９９．９—１９９９。

Ⅰ

書

犌犅／犜１７９９９．１０—２００８

犛犘犉雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

第１０部分：犛犘犉雞間接免疫熒光試驗(yàn)

１范圍

ＧＢ／Ｔ１７９９９的本部分規(guī)定了間接免疫熒光試驗(yàn)的技術(shù)要求等。

本部分適用于對(duì)ＳＰＦ雞進(jìn)行雞傳染性貧血病毒（ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡｎａｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＣＩＡＶ）抗體的

檢測(cè)。

２原理

間接免疫熒光試驗(yàn)，以病毒感染細(xì)胞作抗原，與待檢血清中的特異抗體結(jié)合，再與熒光色素標(biāo)記的

抗抗體結(jié)合，形成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物。熒光色素在紫外光或藍(lán)紫光的作用下，激發(fā)出可見的熒

光，因此出現(xiàn)熒光就說明標(biāo)記物的存在，同時(shí)也反映了特異性抗體的存在。常采用已知抗原及熒光色素

標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)相應(yīng)的抗體。

３試劑和器材

３．１試劑

３．１．１ＣＩＡＶ病毒ＤＥＬＲＯＳＥ株。

３．１．２陰性、陽(yáng)性血清。

３．１．３被檢血清。

３．１．４磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）（見附錄Ａ）。

３．１．５異硫氰熒光素（ＦＩＴＣ）標(biāo)記抗雞ＩｇＧ（按說明稀釋使用）。

３．１．６緩沖甘油或封片劑（見附錄Ａ）。

３．１．７丙酮。

３．２器材

３．２．１抗原片。

３．２．２濕盒。

３．２．３３７℃培養(yǎng)箱。

３．２．４熒光顯微鏡。

４操作程序

４．１感染細(xì)胞的制備

用含１５％新生牛血清的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基在３９℃和５％二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)ＭＤＣＣＭＳＢ１細(xì)胞。

細(xì)胞長(zhǎng)至每毫升５×１０６個(gè)時(shí)（細(xì)胞計(jì)數(shù)參見附錄Ｂ），接種ＣＩＡＶ，并換成含５％新生牛血清的ＤＭＥＭ

培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)３６ｈ～４８ｈ。

４．２抗原片的制備

４．２．１細(xì)胞病變（細(xì)胞體積增大２倍～３倍）約達(dá)５０％～７５％時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，以１５００ｒ／ｍｉｎ離心

１０ｍｉｎ，棄上清液，用ＰＢＳ洗滌細(xì)胞沉淀物３次，并細(xì)胞計(jì)數(shù)，用ＰＢＳ重懸細(xì)胞濃度。