園藝植物組織培養(yǎng)-第2章

第二章實驗設(shè)備及培養(yǎng)條件2023/2/2HuoXW,IMAU實驗室

培養(yǎng)條件OUTLINE2023/2/2HuoXW,IMAU

一個標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實驗室應(yīng)當(dāng)包括：洗滌室、配置室、無菌室、培養(yǎng)室、觀察室等。在實際中可結(jié)合可行條件，合并一部分。一、洗滌室(clean-uproom)二、準(zhǔn)備室(mediapreparationroom)三、接種室(transferroom,sterilizedroomorachamberfortransferringcultures)四、培養(yǎng)室(culturegrowingroom)第一節(jié)實驗室

2023/2/2HuoXW,IMAU光照培養(yǎng)室2023/2/2HuoXW,IMAU接種室2023/2/2HuoXW,IMAU一、洗滌室(clean-uproom)二、準(zhǔn)備室(mediapreparationroom)

準(zhǔn)備室還應(yīng)配備以下儀器設(shè)備：(1)工作臺(2)藥品柜(3)普通冰箱(4)電子分析天平和托盤天平電子分析天平(5)電蒸餾水器(6)磁力攪拌器(7)恒溫水浴鍋(8)電爐或電飯鍋(9)酸度計(10)培養(yǎng)基分裝設(shè)備(11)高壓滅菌鍋(12)恒溫培養(yǎng)箱(13)烘箱2023/2/2HuoXW,IMAU三、接種室(transferroom，sterilizedroom)接種室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1-2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積2平方米為宜。2023/2/2HuoXW,IMAU接種室的主要設(shè)備及用具有：(1)接種箱(2)超凈臺Sterilizedfacility(3)解剖鏡(4)無菌操作用的器具

按單人超凈臺上用量有：酒精燈1個；20-25cm長的醫(yī)用鑷子1把；解剖刀；醫(yī)用剪；廣口瓶，內(nèi)放酒精，用于浸泡鑷子、刀、剪等；用于架放灼燒過的刀、鑷子的小架。

2023/2/2HuoXW,IMAU四、培養(yǎng)室(culturegrowingroom)培養(yǎng)架:培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1.7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，如采用40W日光燈，則長1.3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20-27℃左右.室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70％-80％為好?？刂迫展庹諘r間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長日照植物需要長日照條件。2023/2/2HuoXW,IMAU第二節(jié)培養(yǎng)條件

在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。2023/2/2HuoXW,IMAU一、溫度(temperature)不同植物繁殖的最適溫度不同，大多數(shù)在20--30℃，通常控制在（25+2）℃恒溫條件下培養(yǎng)。溫度過低（≤15℃）或過高（>35℃）都會抑制細(xì)胞、組織的增殖和分化，不利于培養(yǎng)物生長。一些例外情況。利用細(xì)胞培養(yǎng)、低溫保存植物資源時，可在-196℃條件下限制其生長，延長存儲時間。不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是20℃、月季是25-27℃，番茄是28℃。溫度影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，分化增殖、器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。2023/2/2HuoXW,IMAU不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同。

百合鱗片在30-C以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2-5℃條件進(jìn)行一定時間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35℃處理草莓的莖尖分生組織3-5d，可得到無病毒苗。低溫預(yù)處理利于培養(yǎng)。在煙草花藥培養(yǎng)中，在5℃下預(yù)處理48h后進(jìn)行培養(yǎng)，能促進(jìn)體細(xì)胞的形成。在確定某種培養(yǎng)物的適宜溫度時，要考慮原植物的生態(tài)環(huán)境才能獲得最佳效應(yīng)。例如，生長在高海拔和較低溫度環(huán)境下的松樹，若在較高溫度下培養(yǎng)，試管苗生長十分緩慢。2023/2/2HuoXW,IMAU二、光照(1ight)1．光照強(qiáng)度(1ightintensity)光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。一般培養(yǎng)室要求光照12—16h/d，光照度1000-5000lx。不同的培養(yǎng)物對光照有不同的要求。一些植物（如荷蘭芹）的組織培養(yǎng)中，其器官形成不需要光；而另一些植物，如黑穗醋栗，光條件下可顯著提高其幼苗的增殖。同一種植物對光照的要求也不同。百合原球莖在暗培養(yǎng)下長出小球莖，在光照條件下長出葉片。對短日照敏感的葡萄品種，其莖段的組織培養(yǎng)只有在短日照條件下才能形成根；對日照強(qiáng)度不敏感的品種則在任何光周期下都能生根。2023/2/2HuoXW,IMAU2.光質(zhì)(lightwave)光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。不同的光波對器官分化關(guān)系密切。例如，在楊樹愈傷組織的生長中，紅光有促進(jìn)作用，藍(lán)光則有抑制作用。而藍(lán)光明顯促進(jìn)綠豆下胚軸愈傷組織的形成。在煙草愈傷組織的分化培養(yǎng)中，起作用的光譜主要是藍(lán)光區(qū)，紅光和遠(yuǎn)紅光有促進(jìn)芽苗分化的作用。在試管苗生長的后期，加強(qiáng)光照強(qiáng)度，可使小苗生長健壯，提高移苗成活率。2023/2/2HuoXW,IMAU3．光周期(1ighperiod)最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。一般來說，黑暗條件下有利于細(xì)胞、愈傷組織的增殖，但器官的分化往往需要一定的光照。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織。有的植物需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在黑暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。2023/2/2HuoXW,IMAU三、濕度(humidity)

濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件。培養(yǎng)容器濕度?？杀ＷC100%環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，組織培養(yǎng)室內(nèi)一般要求保持70%—80%的相對濕度環(huán)境濕度過高、過低都不利于培養(yǎng)物生長：過低會造成培養(yǎng)基失水干枯而影響培養(yǎng)物的生長分化；過高會造成雜菌滋長導(dǎo)致大量污染。濕度不夠可經(jīng)常拖地或利用保濕機(jī)，濕度過高可利用去濕機(jī)或通風(fēng)除濕。2023/2/2HuoXW,IMAU四、滲透壓(penetratingpressure)滲透壓影響植物細(xì)胞的脫分化和再分化及器官的形成。植物細(xì)胞和培養(yǎng)基之間處于等滲或略低于培養(yǎng)及的滲透壓時，才利于汲取養(yǎng)分和水分。培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物影響到滲透壓的變化。多數(shù)植物適宜的糖濃度為2-6%。通常1-2個大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。2023/2/2HuoXW,IMAU五、pH值外植體的培養(yǎng)增殖都要求一定的pH值。通常培養(yǎng)基的pH值以在5.4～6.0之間較好。如果pH值不適則直接影響外植體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響外植體的脫分化、增殖和器官形成。不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的大多在5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8.

不同植物的最適PH值

種類最適PH值種類最適PH值

杜鵑4．0月季5．8

越桔4．5胡蘿、石刁柏6．0

蠶豆5．5桃7．0

番茄、葡萄5．72023/2/2HuoXW,IMAUpH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。當(dāng)pH值高于6.5時，培養(yǎng)基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。高溫滅菌會降低pH值(約0.2-0.3個pH值)因此在配制時常提高pH值0.2-0.3單位。pH值大小調(diào)整可用0.1M的NaOH和0.1M的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高0.2單位，lml的HCI可使pH值降低0.2單位。2023/2/2HuoXW,IMAU六、氣體(Oxygen)氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。

在接種時應(yīng)避免把整個外植體全部埋人瓊脂中，否則造成缺氧窒息。2023/2/2HuoXW,IMAU胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有兩種再生植株的途徑：先形成根再長成小植株，形成胚狀體后再成苗。與液體培養(yǎng)基中存在的氧濃度有關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)基中氧濃度低于臨界水平時，促進(jìn)形成胚狀體，當(dāng)氧濃度高于臨界水平，則有利于形成根。氧對器官的發(fā)生可能有重要的調(diào)節(jié)作用。2023/2/2H