第四章 熒光分析法

儀器分析第四章熒光分析法學(xué)習(xí)目的

通過(guò)學(xué)習(xí)熒光分析法的基本原理、熒光分光光度計(jì)構(gòu)造及熒光分析的新技術(shù)等內(nèi)容，達(dá)到熟悉熒光分析法在藥物分析中應(yīng)用的目的。學(xué)習(xí)要點(diǎn)

激發(fā)光譜、熒光光譜；產(chǎn)生熒光的條件；熒光強(qiáng)度的影響因素；熒光法分析條件的選擇；熒光法的定量依據(jù)及適用條件。目錄第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光分光光度計(jì)第三節(jié)熒光分析法分析條件的選擇第四節(jié)熒光分析法的應(yīng)用一、熒光發(fā)現(xiàn)16世紀(jì)人們觀察到當(dāng)用紫外和可見(jiàn)光照射到某些物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)就會(huì)發(fā)出不同強(qiáng)度和不同顏色的光，而當(dāng)照射停止時(shí)，物質(zhì)的發(fā)光也隨之很快消失。

直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光度計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍微長(zhǎng)些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長(zhǎng)的光，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。概述二、分子發(fā)光的類(lèi)型1、按激發(fā)的模式分類(lèi)：2、按分子激發(fā)態(tài)的類(lèi)型分類(lèi)：

分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光熱致發(fā)光場(chǎng)致發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光三、熒光分析法的特點(diǎn)1、靈敏度高2、選擇性強(qiáng)3、工作曲線線性范圍寬一、分子熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的外部因素第一節(jié)熒光分析法的基本原理

（一）分子中電子能級(jí)的多重性（二）熒光的產(chǎn)生1、振動(dòng)弛豫2、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換3、熒光發(fā)射4、外部能量轉(zhuǎn)換5、體系間跨越6、磷光發(fā)射一、分子熒光的產(chǎn)生電子的多重態(tài)是一種電子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，用M=2s+1表示，s為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和其值為0或1。

若分子中所有電子都是自旋配對(duì)的，則s=0，M=1，該分子處于單重態(tài)，用S表示。大多數(shù)有機(jī)化合物分子的基態(tài)都處于單重態(tài)。（一）分子中電子能級(jí)的多重性電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

M=2S+1基態(tài)分子吸收能量后，若電子在躍遷過(guò)程中不發(fā)生自旋方向的變化，仍然是M=1，分子處于激發(fā)的多重態(tài)，用S*表示。若電子在躍遷過(guò)程中伴隨自旋方向的變化，分子中便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，s=1，M=3，分子處于激發(fā)的三重態(tài)，用T1*表示。S*與T1*的區(qū)別在于電子自旋方向不同，T1*能級(jí)較S*稍低一些。（一）分子中電子能級(jí)的多重性電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

M=2S+1S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2*內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（二）熒光的產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可通過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷的形式釋放多余能量而返回基態(tài)。輻射躍遷主要涉及熒光、延遲熒光、磷光發(fā)射。無(wú)輻射躍遷指以熱的形式釋放多余的能量，包括振動(dòng)弛豫、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換、體系間跨越、外部能量轉(zhuǎn)換。（二）熒光的產(chǎn)生傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷1、熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)λ′2

的熒光。2、磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1→S0躍遷）。

S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2*內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（二）熒光的產(chǎn)生3、振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。4、內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級(jí)中，等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換的過(guò)程。通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2*內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（二）熒光的產(chǎn)生5、外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“淬滅”。6、系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2*內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（二）熒光的產(chǎn)生（一）激發(fā)光譜與熒光光譜（二）熒光光譜特征

二、激發(fā)光譜與熒光光譜熒光強(qiáng)度：指發(fā)射熒光的光的強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度F與熒光物質(zhì)濃度c，激發(fā)光強(qiáng)度I0的關(guān)系為F=φf(shuō)I0(1-10-εbc)其中φf(shuō)為熒光量子產(chǎn)率，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為液池厚度。該式表明熒光強(qiáng)度與量子產(chǎn)率成正比，但與熒光物質(zhì)濃度沒(méi)有直線關(guān)系。稀溶液時(shí)，上式簡(jiǎn)化為

F=2.3φf(shuō)I0εbc=Kc此時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比。（一）激發(fā)光譜與熒光光譜1、激發(fā)光譜曲線（F?λex曲線）固定熒光的發(fā)射波長(zhǎng)(即測(cè)定波長(zhǎng)),改變?nèi)肷涔獠ㄩL(zhǎng),得到熒光(磷光)強(qiáng)度與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。

2、熒光光譜（F?λem曲線）固定激發(fā)光波長(zhǎng)(入射光波長(zhǎng)),改變熒光的測(cè)定波長(zhǎng)(發(fā)射波長(zhǎng)),得到熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。（一）激發(fā)光譜與熒光光譜

硫酸奎寧的激發(fā)光譜（a）及熒光光譜（b）1、Stokes位移指相同電子躍遷在吸收光譜和發(fā)射光譜中最強(qiáng)波長(zhǎng)間的差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，由于振動(dòng)弛豫等原因消耗了能量。（二）熒光光譜特征

2、熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)一般情況下，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光來(lái)激發(fā)熒光分子，得到的熒光發(fā)射光譜的形狀基本相同。原因：熒光均由第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)產(chǎn)生的。不同激發(fā)波長(zhǎng)下維生素B2熒光光譜圖

（二）熒光光譜特征

3、熒光光譜與激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系激發(fā)光譜與熒光光譜形狀相似，存在“鏡像對(duì)稱(chēng)”關(guān)系。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜（二）熒光光譜特征

室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜

（二）熒光光譜特征

（一）熒光效率（二）熒光壽命（三）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

三、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光效率也叫熒光量子產(chǎn)率,指物質(zhì)發(fā)射熒光的量子數(shù)與所吸收的激發(fā)光量子數(shù)的比值，用φf(shuō)表示：熒光素鈉在水中φf(shuō)=0.92；在乙醇中蒽φf(shuō)=0.30、菲φf(shuō)=0.10。熒光效率低的物質(zhì)，雖有強(qiáng)紫外吸收，但沒(méi)有熒光發(fā)射?；衔飂0.110.290.460.600.52（一）熒光效率指除去激發(fā)光源后，熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，用τf表示。F0為激發(fā)時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)t為激發(fā)后時(shí)間t的熒光強(qiáng)度，以ln(F0/Ft)對(duì)t作直線，直線的斜率即為1/τf。（二）熒光壽命分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光起決定作用。1、共軛結(jié)構(gòu)2、分子的剛性平面結(jié)構(gòu)3、取代基效應(yīng)（三）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1、共軛效應(yīng)產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生。化合物苯萘蒽λex(max)(nm)205286365λem(max)

(nm)278321404F0.110.290.46（三）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

2、剛性平面結(jié)構(gòu)熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)發(fā)生長(zhǎng)移。芴聯(lián)二苯F=1.0F=0.2紅色熒光弱熒光（三）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系Mg2+萘維生素A8-羥基喹啉3、取代基效應(yīng)（1）給電子取代基加強(qiáng)熒光如：—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN（2）吸電子取代基減弱熒光

如：—C=O，—COOH，—NO2（3）與電子共軛體系作用較小的取代基，對(duì)熒光影響不明顯。如：—SO3H，—NH3+

，—R（三）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（一）溶劑的影響（二）溫度的影響（三）pH值的影響（四）散射光的影響（五）熒光熄滅劑的影響四、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溶劑的極性：對(duì)許多共軛芳族化合物，激發(fā)時(shí)發(fā)生了

→*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降的更多，熒光光譜向長(zhǎng)波移動(dòng)。2、氫鍵溶劑形成氫鍵的能力增大，熒光光譜向短波移動(dòng)。3、溶劑黏度介質(zhì)黏度的提高，將減小激發(fā)態(tài)分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)的速率，同時(shí)降低與其他溶質(zhì)分子的碰撞概率，有利于提高熒光或磷光的強(qiáng)度。（一）溶劑的影響溫度上升，將使激發(fā)態(tài)分子的振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化作用加劇，同時(shí)增大了發(fā)光分子與溶劑分子碰撞失活的機(jī)會(huì)，將導(dǎo)致溶液熒光和磷光效率和強(qiáng)度下降。熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，每降低10℃，φf(shuō)增加3%，在-80℃時(shí)，φf(shuō)為1。（二）溫度的影響對(duì)酸堿型熒光物質(zhì)，在不同的溶液pH下，熒光物質(zhì)的存在形式不同，因而具有不同的熒光。（三）pH值的影響散射光分為瑞利光和拉曼光。瑞利光：指光子和物質(zhì)分子相碰撞時(shí)，不發(fā)生能量的交換，光子的頻率并未改變，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的散射光。拉曼光：指光子和物質(zhì)分子相碰撞時(shí)，有部分光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，在光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變同時(shí)，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量的交換，光子頻率發(fā)生改變的散射光。（四）色散光的影響散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)可消除。（四）色散光的影響1、熒光熄滅（熒光淬滅）指熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。2、熒光熄滅劑指能與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。3、熒光熄滅類(lèi)型(1)碰撞淬滅；(2)生成化合物的淬滅(靜態(tài)淬滅)；(3)能量轉(zhuǎn)移淬滅；(4)氧的淬滅；(5)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的淬滅；(6)濃度過(guò)大引起的自淬滅。（五）熒光熄滅劑的影響一、熒光分光光度計(jì)（一）光源（二）單色器（三）樣品池（四）檢測(cè)器（五）信號(hào)顯示記錄器二、熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介（一）同步熒光分析法（二）三維熒光分析法（三）時(shí)間分辨熒光分析法第二節(jié)熒光分光光度計(jì)一、熒光分光光度計(jì)光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器（一）光源氙燈，發(fā)射強(qiáng)度大，250nm~700nm范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，300~400nm波段內(nèi)的譜線強(qiáng)度幾乎相等。（二）單色器兩個(gè)光柵單色器。激發(fā)單色器置于樣品池前，用于選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)；發(fā)射單色器置于樣品池和檢測(cè)器間，用于選擇熒光發(fā)射波長(zhǎng)，并消除其他雜散光的干擾。一、熒光分光光度計(jì)（三）樣品池通常用低熒光的石英材料制成，四面均為磨光透明面，厚度1cm。問(wèn)題：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么異同？（1）樣品池的材料：與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池一樣。（2）吸收池的形狀：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)吸收池兩面透光，熒光分光光度計(jì)樣品池四面透光。（3）

使用注意事項(xiàng)：波長(zhǎng)范圍、容易破碎、沾污問(wèn)題。一、熒光分光光度計(jì)（四）檢測(cè)器光電倍增管，電感耦合器件（CCD）。放大倍數(shù)：2n~5n（n=10），103~107，最大108~109（五）信號(hào)顯示記錄器計(jì)算機(jī)光譜工作站，對(duì)數(shù)字信號(hào)進(jìn)行采集、處理、顯示，并對(duì)各系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)控制。一、熒光分光光度計(jì)（一）同步熒光分析法（二）三維熒光分析法（三）時(shí)間分辨熒光分析法二、熒光分析新技術(shù)該法同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長(zhǎng)，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)構(gòu)成光譜圖。有如下方式：①固定波長(zhǎng)差同步掃描法。②固定能量差同步掃描法。③可變波長(zhǎng)（可變角）同步掃描法。（一）同步熒光分析法①固定波長(zhǎng)差同步掃描法。3種芬芳族化合物p-terphenyl、anthracene和perylene混合。在一個(gè)固定的激發(fā)光下，發(fā)射光掃描(藍(lán)色曲線)不能顯示混合物中的組成。20nm間隔的同步掃描(黑色曲線)在3種物質(zhì)各自發(fā)射光值最大時(shí)，顯示出3段明顯的波峰。（一）同步熒光分析法②固定能量差同步掃描法。③可變波長(zhǎng)（可變角）同步掃描法。（一）同步熒光分析法特點(diǎn)：簡(jiǎn)化譜圖，減小了譜圖重復(fù)現(xiàn)象和散射光的影響，提高選擇性；但損失了其它光譜帶，提供的信息量減少。適合多組分混合物的分析，可應(yīng)用于不同基因的分型、正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的區(qū)分等。（一）同步熒光分析法該法描述熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化關(guān)系的譜圖，能提供比常規(guī)熒光光譜和倒數(shù)熒光光譜更完整的光譜信息?？捎糜谀承┌┘?xì)胞的熒光代謝物的檢測(cè)，以區(qū)分癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞。（二）三維熒光分析法利用稀土配合物具有長(zhǎng)壽命熒光，在樣品被脈沖光激發(fā)后、熒光信號(hào)采集前，根據(jù)樣品中所包含的熒光物質(zhì)熒光壽命的不同引入一定的延遲時(shí)間(delaytime)，待短壽命的背景熒光完全淬滅后，再對(duì)長(zhǎng)壽命的特異性熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。該法以具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合劑作為示蹤物，可標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞。（三）時(shí)間分辨熒光分析法鑭系金屬離子螯合物的熒光壽命（微秒級(jí)）較長(zhǎng)，通過(guò)時(shí)間分辨方式可以區(qū)別于傳統(tǒng)短熒光壽命的背景熒光（納秒級(jí)），可完全消除背景熒光的干擾。鑭系金屬離子螯合物的熒光很寬的Stoke位移（200nm以上）使其容易通過(guò)波長(zhǎng)分辨方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光，可提高方法學(xué)的穩(wěn)定性。鑭系金屬離子螯合物狹窄的熒光發(fā)射峰（半峰寬10~15

nm）使其熒光檢測(cè)具有很高的效率，提高了檢測(cè)的特異性和靈敏性。（三）時(shí)間分辨熒光分析法第三節(jié)熒光分析法分析條件的選擇

一、激發(fā)波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)的選擇二、空白溶液的選擇三、熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系四、定量分析方法的選擇一、激發(fā)波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)的選擇1、查閱文獻(xiàn)，了解其是否產(chǎn)生熒光；2、掃描其紫外-可見(jiàn)吸收光譜，找到最大吸收波長(zhǎng)；3、在最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行熒光激發(fā)，測(cè)定其發(fā)射光譜，找到熒光發(fā)射最大的波長(zhǎng)；4、以發(fā)射最大波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定激發(fā)光譜，找到最大激發(fā)波長(zhǎng)。5、選擇在最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)處進(jìn)行物質(zhì)測(cè)定。二、空白溶液的選擇1、溶劑空白用溶劑做空白溶液，簡(jiǎn)稱(chēng)溶劑空白。2、試劑空白按照與顯色反應(yīng)相同的條件（不加樣品），同時(shí)加入各種試劑和溶劑作為空白溶液，稱(chēng)為試劑空白。3、平行操作空白用不含待測(cè)組分的樣品，按照與樣品分析相同的條件與樣品平行操作，稱(chēng)為平行操作空白。F=2.3φf(shuō)I0εbc=Kc

F=2.303K'I0Elc=KcEL=V·hvF為熒光強(qiáng)度，I0為入射光強(qiáng)度，I為通過(guò)厚度為l的介質(zhì)后的光強(qiáng)度，K‘為常數(shù)（取決于熒光效率φf(shuō)和檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度）。在低濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度成正比關(guān)系。在高濃度時(shí)，由于淬滅和自吸等原因使熒光強(qiáng)度和濃度之間不成線性關(guān)系。三、熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系（一）單組分的熒光測(cè)定

1、直接測(cè)定法2、間接測(cè)定法（二）多組分混合物的熒光分析

1、不干擾，當(dāng)單組分處理

2、有干擾，可選擇不同激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定四、定量分析方法的選擇1、直接測(cè)定法通過(guò)測(cè)定被分析物的熒光強(qiáng)度來(lái)確定其濃度。2、間接測(cè)定法（1）通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使無(wú)熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合測(cè)定的熒光物質(zhì)；（2）通過(guò)熒光熄滅法測(cè)定熒光熄滅劑的濃度。如過(guò)渡金屬離子與具有熒光性質(zhì)的芳香族配位體絡(luò)合后，可使配位體熒光熄滅，從而間接測(cè)定金屬離子。（一）單組分的熒光測(cè)定1、當(dāng)混合物中各個(gè)組分的熒光峰不重疊，彼此干擾很小時(shí)，可分別性質(zhì)在不同的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定各個(gè)組分的熒光強(qiáng)度。2、當(dāng)混合物中各個(gè)組分的熒光峰彼此重疊時(shí)，若其激發(fā)光譜有顯著的差別，這時(shí)可選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。（二）多組分混合物的熒光分析3、在選擇激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)后仍無(wú)法分別測(cè)定混合物中的各組分時(shí)，可嘗試同步熒光測(cè)定、導(dǎo)數(shù)熒光測(cè)定等方法。（二）多組分混合物的熒光分析1、原理該法利用衍生的方法將自身不發(fā)熒光的分析物，轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)熒光的化合物，通過(guò)測(cè)定該化合物的熒光強(qiáng)度間接測(cè)定分析物。2、分類(lèi)可分為化學(xué)衍生法、電化學(xué)衍生法、光化學(xué)衍生法。五、熒光衍生法3、衍生化試劑需滿足以下條件：（1）能在緩和條件下與被測(cè)物質(zhì)快速定量反應(yīng)；（2）生成的熒光衍生物應(yīng)有良好穩(wěn)定性；（3）若需經(jīng)過(guò)色譜過(guò)程進(jìn)行分離，則色譜分離后衍生化試劑本身應(yīng)無(wú)熒光。五、熒光衍生法4、常用衍生化試劑（1）熒光胺能與脂肪族或芳香族伯胺類(lèi)形成高度熒光衍生物。熒光胺及其水解物不顯熒光。熒光條件：ex=275、390nm，em=480nm。五、熒光衍生法（2）丹磺酰氯[5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯]用于測(cè)定胺、蛋白質(zhì)、多肽N-端氨基酸?？膳c脂肪族或芳香族伯胺類(lèi)反應(yīng)生成磺胺，產(chǎn)生藍(lán)色或藍(lán)綠色熒光。可與肽的N-端氨基酸反應(yīng)，生成丹磺酰-肽，水解得到有強(qiáng)烈熒光的丹磺酰-氨基酸，用于蛋白質(zhì)測(cè)序和氨基酸測(cè)序。熒光條件：ex=350nm，em=500nm。五、熒光衍生法第四節(jié)熒光分析法的應(yīng)用一、定性分析二、定量分析三、應(yīng)用與示例

一、定性分析熒光激發(fā)光譜和熒光光譜可作為定性分析的手段，用以鑒定化合物。根據(jù)試樣圖譜、熒光峰波長(zhǎng)，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。

一、定性分析熒光激發(fā)光譜和熒光光譜可作為定性分析的手段，用以鑒定化合物。根據(jù)試樣圖譜、熒光峰波長(zhǎng)，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。二、定量分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法常采用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中的某一溶液作為基準(zhǔn)，先將空白溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)至0，再將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)至100或50，然后測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。再在同樣條件下測(cè)定試樣的熒光強(qiáng)度，利用回歸方程求出試樣的含量。FCsFxCx二、定量分析為使不同時(shí)間繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線前后一致，每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，均可采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校正。如果試樣溶液在紫外光照射下不穩(wěn)定，則須改用另一種性質(zhì)穩(wěn)定，而且熒光峰形和試樣溶液近似的對(duì)照品溶液作為基準(zhǔn)。二、定量分析如測(cè)定維生素B1時(shí)，采用硫酸奎寧的0.05mol/LH2SO4溶液作為基準(zhǔn)（校正儀器）。黃綠色熒光（維生素B2）可用熒光素鈉的水溶液為基準(zhǔn)。紅色熒光可用羅丹明B水溶液為基準(zhǔn)。二、定量分析2、比例法如果標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)零點(diǎn)，可用比例法測(cè)定。配制一標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在線性范圍內(nèi)，測(cè)定熒光強(qiáng)度Fs，然后在同樣條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度Fx。由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Cs按下式可求得試樣中熒光物質(zhì)的濃度Cx或含量。若空白溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)不到0，則Fs及Fx值要扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度F0后，按下式計(jì)算。對(duì)照品和樣品溶液的濃度要盡可能接近，以減小誤差。（一）無(wú)機(jī)化合物的熒光分析（二）合成藥物的熒光分析（三）中藥的熒光分析三、應(yīng)用與示例1、直接熒光測(cè)定法待測(cè)元素與有機(jī)溶劑組成能發(fā)熒光的配合物，通過(guò)檢測(cè)配合物的熒光強(qiáng)度以測(cè)定該元素的含量。常用該法進(jìn)行測(cè)定的元素有鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素。（一）無(wú)機(jī)化合物的熒光分析2、熒光熄滅測(cè)定法某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會(huì)與發(fā)熒光的配合物爭(zhēng)奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的的含強(qiáng)度測(cè)定此該元素量。如