第四章 熒光分析法

儀器分析第四章熒光分析法學習目的

通過學習熒光分析法的基本原理、熒光分光光度計構造及熒光分析的新技術等內容，達到熟悉熒光分析法在藥物分析中應用的目的。學習要點

激發(fā)光譜、熒光光譜；產(chǎn)生熒光的條件；熒光強度的影響因素；熒光法分析條件的選擇；熒光法的定量依據(jù)及適用條件。目錄第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光分光光度計第三節(jié)熒光分析法分析條件的選擇第四節(jié)熒光分析法的應用一、熒光發(fā)現(xiàn)16世紀人們觀察到當用紫外和可見光照射到某些物質時，這些物質就會發(fā)出不同強度和不同顏色的光，而當照射停止時，物質的發(fā)光也隨之很快消失。

直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光光度計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，從而導入了熒光是光發(fā)射的概念。概述二、分子發(fā)光的類型1、按激發(fā)的模式分類：2、按分子激發(fā)態(tài)的類型分類：

分子發(fā)光光致發(fā)光化學發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光三、熒光分析法的特點1、靈敏度高2、選擇性強3、工作曲線線性范圍寬一、分子熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光與分子結構的關系四、影響熒光強度的外部因素第一節(jié)熒光分析法的基本原理

（一）分子中電子能級的多重性（二）熒光的產(chǎn)生1、振動弛豫2、內部能量轉換3、熒光發(fā)射4、外部能量轉換5、體系間跨越6、磷光發(fā)射一、分子熒光的產(chǎn)生電子的多重態(tài)是一種電子的運動狀態(tài)，用M=2s+1表示，s為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和其值為0或1。

若分子中所有電子都是自旋配對的，則s=0，M=1，該分子處于單重態(tài)，用S表示。大多數(shù)有機化合物分子的基態(tài)都處于單重態(tài)。（一）分子中電子能級的多重性電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

M=2S+1基態(tài)分子吸收能量后，若電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，仍然是M=1，分子處于激發(fā)的多重態(tài)，用S*表示。若電子在躍遷過程中伴隨自旋方向的變化，分子中便具有兩個自旋不配對的電子，s=1，M=3，分子處于激發(fā)的三重態(tài)，用T1*表示。S*與T1*的區(qū)別在于電子自旋方向不同，T1*能級較S*稍低一些。（一）分子中電子能級的多重性電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

M=2S+1S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2*內轉換振動弛豫（二）熒光的產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可通過輻射躍遷和非輻射躍遷的形式釋放多余能量而返回基態(tài)。輻射躍遷主要涉及熒光、延遲熒光、磷光發(fā)射。無輻射躍遷指以熱的形式釋放多余的能量，包括振動弛豫、內部能量轉換、體系間跨越、外部能量轉換。（二）熒光的產(chǎn)生傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內轉換外轉換系間跨越振動弛豫無輻射躍遷1、熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長λ′2

的熒光。2、磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）。

S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2*內轉換振動弛豫（二）熒光的產(chǎn)生3、振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。4、內轉換：同多重態(tài)電子能級中，等能級間的無輻射能級交換的過程。通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2*內轉換振動弛豫（二）熒光的產(chǎn)生5、外轉換：激發(fā)分子與溶劑或其他溶質分子之間產(chǎn)生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷。外轉換使熒光或磷光減弱或“淬滅”。6、系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。S2*S1*S0T1*吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2*內轉換振動弛豫（二）熒光的產(chǎn)生（一）激發(fā)光譜與熒光光譜（二）熒光光譜特征

二、激發(fā)光譜與熒光光譜熒光強度：指發(fā)射熒光的光的強度。熒光強度F與熒光物質濃度c，激發(fā)光強度I0的關系為F=φfI0(1-10-εbc)其中φf為熒光量子產(chǎn)率，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為液池厚度。該式表明熒光強度與量子產(chǎn)率成正比，但與熒光物質濃度沒有直線關系。稀溶液時，上式簡化為

F=2.3φfI0εbc=Kc此時，熒光強度與熒光物質濃度成正比。（一）激發(fā)光譜與熒光光譜1、激發(fā)光譜曲線（F?λex曲線）固定熒光的發(fā)射波長(即測定波長),改變入射光波長,得到熒光(磷光)強度與入射光波長的關系曲線。

2、熒光光譜（F?λem曲線）固定激發(fā)光波長(入射光波長),改變熒光的測定波長(發(fā)射波長),得到熒光強度與發(fā)射光波長關系曲線。（一）激發(fā)光譜與熒光光譜

硫酸奎寧的激發(fā)光譜（a）及熒光光譜（b）1、Stokes位移指相同電子躍遷在吸收光譜和發(fā)射光譜中最強波長間的差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，由于振動弛豫等原因消耗了能量。（二）熒光光譜特征

2、熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關一般情況下，用不同波長的激發(fā)光來激發(fā)熒光分子，得到的熒光發(fā)射光譜的形狀基本相同。原因：熒光均由第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)產(chǎn)生的。不同激發(fā)波長下維生素B2熒光光譜圖

（二）熒光光譜特征

3、熒光光譜與激發(fā)光譜成鏡像關系激發(fā)光譜與熒光光譜形狀相似，存在“鏡像對稱”關系。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜（二）熒光光譜特征

室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜

（二）熒光光譜特征

（一）熒光效率（二）熒光壽命（三）分子結構與熒光的關系

三、熒光與分子結構的關系熒光效率也叫熒光量子產(chǎn)率,指物質發(fā)射熒光的量子數(shù)與所吸收的激發(fā)光量子數(shù)的比值，用φf表示：熒光素鈉在水中φf=0.92；在乙醇中蒽φf=0.30、菲φf=0.10。熒光效率低的物質，雖有強紫外吸收，但沒有熒光發(fā)射?；衔飂0.110.290.460.600.52（一）熒光效率指除去激發(fā)光源后，熒光強度降低到最大熒光強度的1/e所需的時間，用τf表示。F0為激發(fā)時的熒光強度，F(xiàn)t為激發(fā)后時間t的熒光強度，以ln(F0/Ft)對t作直線，直線的斜率即為1/τf。（二）熒光壽命分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）強的紫外-可見吸收；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

分子結構對熒光起決定作用。1、共軛結構2、分子的剛性平面結構3、取代基效應（三）分子結構與熒光的關系1、共軛效應產(chǎn)生熒光的有機物質，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生。化合物苯萘蒽λex(max)(nm)205286365λem(max)

(nm)278321404F0.110.290.46（三）分子結構與熒光的關系

2、剛性平面結構熒光物質的剛性和平面性增加，熒光效率越大，熒光波長發(fā)生長移。芴聯(lián)二苯F=1.0F=0.2紅色熒光弱熒光（三）分子結構與熒光的關系Mg2+萘維生素A8-羥基喹啉3、取代基效應（1）給電子取代基加強熒光如：—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN（2）吸電子取代基減弱熒光

如：—C=O，—COOH，—NO2（3）與電子共軛體系作用較小的取代基，對熒光影響不明顯。如：—SO3H，—NH3+

，—R（三）分子結構與熒光的關系（一）溶劑的影響（二）溫度的影響（三）pH值的影響（四）散射光的影響（五）熒光熄滅劑的影響四、影響熒光強度的外部因素1、溶劑的極性：對許多共軛芳族化合物，激發(fā)時發(fā)生了

→*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降的更多，熒光光譜向長波移動。2、氫鍵溶劑形成氫鍵的能力增大，熒光光譜向短波移動。3、溶劑黏度介質黏度的提高，將減小激發(fā)態(tài)分子振動和轉動的速率，同時降低與其他溶質分子的碰撞概率，有利于提高熒光或磷光的強度。（一）溶劑的影響溫度上升，將使激發(fā)態(tài)分子的振動馳豫和內轉化作用加劇，同時增大了發(fā)光分子與溶劑分子碰撞失活的機會，將導致溶液熒光和磷光效率和強度下降。熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，每降低10℃，φf增加3%，在-80℃時，φf為1。（二）溫度的影響對酸堿型熒光物質，在不同的溶液pH下，熒光物質的存在形式不同，因而具有不同的熒光。（三）pH值的影響散射光分為瑞利光和拉曼光。瑞利光：指光子和物質分子相碰撞時，不發(fā)生能量的交換，光子的頻率并未改變，只是光子運動方向發(fā)生改變的散射光。拉曼光：指光子和物質分子相碰撞時，有部分光子和物質分子發(fā)生非彈性碰撞，在光子運動方向發(fā)生改變同時，光子把部分能量轉移給物質分子或從物質分子獲得部分能量的交換，光子頻率發(fā)生改變的散射光。（四）色散光的影響散射光對熒光測定有干擾，選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長可消除。（四）色散光的影響1、熒光熄滅（熒光淬滅）指熒光分子與溶劑分子或其它溶質分子相互作用引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象。2、熒光熄滅劑指能與熒光物質分子發(fā)生相互作用而引起熒光強度下降的物質。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。3、熒光熄滅類型(1)碰撞淬滅；(2)生成化合物的淬滅(靜態(tài)淬滅)；(3)能量轉移淬滅；(4)氧的淬滅；(5)轉入三重態(tài)的淬滅；(6)濃度過大引起的自淬滅。（五）熒光熄滅劑的影響一、熒光分光光度計（一）光源（二）單色器（三）樣品池（四）檢測器（五）信號顯示記錄器二、熒光分析新技術簡介（一）同步熒光分析法（二）三維熒光分析法（三）時間分辨熒光分析法第二節(jié)熒光分光光度計一、熒光分光光度計光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器（一）光源氙燈，發(fā)射強度大，250nm~700nm范圍內的連續(xù)光譜，300~400nm波段內的譜線強度幾乎相等。（二）單色器兩個光柵單色器。激發(fā)單色器置于樣品池前，用于選擇激發(fā)光的波長；發(fā)射單色器置于樣品池和檢測器間，用于選擇熒光發(fā)射波長，并消除其他雜散光的干擾。一、熒光分光光度計（三）樣品池通常用低熒光的石英材料制成，四面均為磨光透明面，厚度1cm。問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么異同？（1）樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣。（2）吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計吸收池兩面透光，熒光分光光度計樣品池四面透光。（3）

使用注意事項：波長范圍、容易破碎、沾污問題。一、熒光分光光度計（四）檢測器光電倍增管，電感耦合器件（CCD）。放大倍數(shù)：2n~5n（n=10），103~107，最大108~109（五）信號顯示記錄器計算機光譜工作站，對數(shù)字信號進行采集、處理、顯示，并對各系統(tǒng)進行自動控制。一、熒光分光光度計（一）同步熒光分析法（二）三維熒光分析法（三）時間分辨熒光分析法二、熒光分析新技術該法同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發(fā)波長構成光譜圖。有如下方式：①固定波長差同步掃描法。②固定能量差同步掃描法。③可變波長（可變角）同步掃描法。（一）同步熒光分析法①固定波長差同步掃描法。3種芬芳族化合物p-terphenyl、anthracene和perylene混合。在一個固定的激發(fā)光下，發(fā)射光掃描(藍色曲線)不能顯示混合物中的組成。20nm間隔的同步掃描(黑色曲線)在3種物質各自發(fā)射光值最大時，顯示出3段明顯的波峰。（一）同步熒光分析法②固定能量差同步掃描法。③可變波長（可變角）同步掃描法。（一）同步熒光分析法特點：簡化譜圖，減小了譜圖重復現(xiàn)象和散射光的影響，提高選擇性；但損失了其它光譜帶，提供的信息量減少。適合多組分混合物的分析，可應用于不同基因的分型、正常細胞與腫瘤細胞的區(qū)分等。（一）同步熒光分析法該法描述熒光強度同時隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化關系的譜圖，能提供比常規(guī)熒光光譜和倒數(shù)熒光光譜更完整的光譜信息?？捎糜谀承┌┘毎臒晒獯x物的檢測，以區(qū)分癌細胞與非癌細胞。（二）三維熒光分析法利用稀土配合物具有長壽命熒光，在樣品被脈沖光激發(fā)后、熒光信號采集前，根據(jù)樣品中所包含的熒光物質熒光壽命的不同引入一定的延遲時間(delaytime)，待短壽命的背景熒光完全淬滅后，再對長壽命的特異性熒光信號進行測定。該法以具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物，可標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞。（三）時間分辨熒光分析法鑭系金屬離子螯合物的熒光壽命（微秒級）較長，通過時間分辨方式可以區(qū)別于傳統(tǒng)短熒光壽命的背景熒光（納秒級），可完全消除背景熒光的干擾。鑭系金屬離子螯合物的熒光很寬的Stoke位移（200nm以上）使其容易通過波長分辨方式進一步區(qū)別于背景熒光，可提高方法學的穩(wěn)定性。鑭系金屬離子螯合物狹窄的熒光發(fā)射峰（半峰寬10~15

nm）使其熒光檢測具有很高的效率，提高了檢測的特異性和靈敏性。（三）時間分辨熒光分析法第三節(jié)熒光分析法分析條件的選擇

一、激發(fā)波長與熒光波長的選擇二、空白溶液的選擇三、熒光強度與濃度的關系四、定量分析方法的選擇一、激發(fā)波長與熒光波長的選擇1、查閱文獻，了解其是否產(chǎn)生熒光；2、掃描其紫外-可見吸收光譜，找到最大吸收波長；3、在最大吸收波長進行熒光激發(fā)，測定其發(fā)射光譜，找到熒光發(fā)射最大的波長；4、以發(fā)射最大波長作為發(fā)射波長，測定激發(fā)光譜，找到最大激發(fā)波長。5、選擇在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長處進行物質測定。二、空白溶液的選擇1、溶劑空白用溶劑做空白溶液，簡稱溶劑空白。2、試劑空白按照與顯色反應相同的條件（不加樣品），同時加入各種試劑和溶劑作為空白溶液，稱為試劑空白。3、平行操作空白用不含待測組分的樣品，按照與樣品分析相同的條件與樣品平行操作，稱為平行操作空白。F=2.3φfI0εbc=Kc

F=2.303K'I0Elc=KcEL=V·hvF為熒光強度，I0為入射光強度，I為通過厚度為l的介質后的光強度，K‘為常數(shù)（取決于熒光效率φf和檢測系統(tǒng)靈敏度）。在低濃度時，熒光強度與物質濃度成正比關系。在高濃度時，由于淬滅和自吸等原因使熒光強度和濃度之間不成線性關系。三、熒光強度與濃度的關系（一）單組分的熒光測定

1、直接測定法2、間接測定法（二）多組分混合物的熒光分析

1、不干擾，當單組分處理

2、有干擾，可選擇不同激發(fā)波長測定四、定量分析方法的選擇1、直接測定法通過測定被分析物的熒光強度來確定其濃度。2、間接測定法（1）通過化學反應使無熒光物質轉變?yōu)檫m合測定的熒光物質；（2）通過熒光熄滅法測定熒光熄滅劑的濃度。如過渡金屬離子與具有熒光性質的芳香族配位體絡合后，可使配位體熒光熄滅，從而間接測定金屬離子。（一）單組分的熒光測定1、當混合物中各個組分的熒光峰不重疊，彼此干擾很小時，可分別性質在不同的發(fā)射波長測定各個組分的熒光強度。2、當混合物中各個組分的熒光峰彼此重疊時，若其激發(fā)光譜有顯著的差別，這時可選擇不同的激發(fā)波長進行測定。（二）多組分混合物的熒光分析3、在選擇激發(fā)波長和發(fā)射波長后仍無法分別測定混合物中的各組分時，可嘗試同步熒光測定、導數(shù)熒光測定等方法。（二）多組分混合物的熒光分析1、原理該法利用衍生的方法將自身不發(fā)熒光的分析物，轉變?yōu)榘l(fā)熒光的化合物，通過測定該化合物的熒光強度間接測定分析物。2、分類可分為化學衍生法、電化學衍生法、光化學衍生法。五、熒光衍生法3、衍生化試劑需滿足以下條件：（1）能在緩和條件下與被測物質快速定量反應；（2）生成的熒光衍生物應有良好穩(wěn)定性；（3）若需經(jīng)過色譜過程進行分離，則色譜分離后衍生化試劑本身應無熒光。五、熒光衍生法4、常用衍生化試劑（1）熒光胺能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物。熒光胺及其水解物不顯熒光。熒光條件：ex=275、390nm，em=480nm。五、熒光衍生法（2）丹磺酰氯[5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯]用于測定胺、蛋白質、多肽N-端氨基酸?？膳c脂肪族或芳香族伯胺類反應生成磺胺，產(chǎn)生藍色或藍綠色熒光。可與肽的N-端氨基酸反應，生成丹磺酰-肽，水解得到有強烈熒光的丹磺酰-氨基酸，用于蛋白質測序和氨基酸測序。熒光條件：ex=350nm，em=500nm。五、熒光衍生法第四節(jié)熒光分析法的應用一、定性分析二、定量分析三、應用與示例

一、定性分析熒光激發(fā)光譜和熒光光譜可作為定性分析的手段，用以鑒定化合物。根據(jù)試樣圖譜、熒光峰波長，與標準品進行比較。

一、定性分析熒光激發(fā)光譜和熒光光譜可作為定性分析的手段，用以鑒定化合物。根據(jù)試樣圖譜、熒光峰波長，與標準品進行比較。二、定量分析1、標準曲線法常采用標準溶液系列中的某一溶液作為基準，先將空白溶液的熒光強度調至0，再將該標準溶液的熒光強度調至100或50，然后測定系列標準溶液的熒光強度，繪制標準曲線，計算回歸方程。再在同樣條件下測定試樣的熒光強度，利用回歸方程求出試樣的含量。FCsFxCx二、定量分析為使不同時間繪制的標準曲線前后一致，每次繪制標準曲線時，均可采用統(tǒng)一標準物質進行校正。如果試樣溶液在紫外光照射下不穩(wěn)定，則須改用另一種性質穩(wěn)定，而且熒光峰形和試樣溶液近似的對照品溶液作為基準。二、定量分析如測定維生素B1時，采用硫酸奎寧的0.05mol/LH2SO4溶液作為基準（校正儀器）。黃綠色熒光（維生素B2）可用熒光素鈉的水溶液為基準。紅色熒光可用羅丹明B水溶液為基準。二、定量分析2、比例法如果標準曲線過零點，可用比例法測定。配制一標準溶液，使其濃度在線性范圍內，測定熒光強度Fs，然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度Fx。由標準溶液的濃度Cs按下式可求得試樣中熒光物質的濃度Cx或含量。若空白溶液的熒光強度調不到0，則Fs及Fx值要扣除空白溶液的熒光強度F0后，按下式計算。對照品和樣品溶液的濃度要盡可能接近，以減小誤差。（一）無機化合物的熒光分析（二）合成藥物的熒光分析（三）中藥的熒光分析三、應用與示例1、直接熒光測定法待測元素與有機溶劑組成能發(fā)熒光的配合物，通過檢測配合物的熒光強度以測定該元素的含量。常用該法進行測定的元素有鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素。（一）無機化合物的熒光分析2、熒光熄滅測定法某些元素雖然不與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會與發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的的含強度測定此該元素量。如