屆藥學(xué)專業(yè)本科生畢業(yè)論文

本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）題姓學(xué)專班學(xué)

目名院業(yè)級號

白藜蘆醇對亞硝酸鹽清除及亞硝胺阻斷作用研究劉玉鋒食品藥品學(xué)院藥物制劑09級2班2303090213精選資料導(dǎo)教:

張孝林

職:

講師2012年12安徽科技學(xué)院教務(wù)處可修改編輯2222目

錄摘要·················································································································1關(guān)鍵··············································································································1前言·················································································································11劑和儀····································································································21.1試劑···········································································································21.2儀器···········································································································22原理·············································································································22.1亞硝酸鈉的清除率的測定···········································································22.2阻斷亞硝胺合成的原···············································································23驗方法·······································································································33.1溶液的配·································································································33.2NaNO標準液的制備及吸光度的測定·······················································33.3不同濃度白藜蘆醇溶液在時對亞硝酸鈉的清除率的測定··················43.4不同濃度白藜蘆醇溶液在時對亞硝胺合成的阻斷率測定··················44結(jié)果及分···································································································54.1NaNO溶液的標準曲線的繪制···································································54.2不同濃度的白藜蘆醇在對亞硝酸鈉的清除率及對亞硝胺的阻斷率·55論及結(jié)····································································································7致謝·················································································································7參考文獻··········································································································8精選資料英文摘要··········································································································9白藜蘆對硝酸鹽清及亞硝阻斷作研究藥物制劑：劉玉鋒指導(dǎo)老師：張孝林摘：目：以亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率為指標，研究不同濃度的白蘆醇在酸性下對亞硝酸鹽的清除和對亞硝胺合成的阻斷作用。

方法分別配制0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL濃的白藜蘆醇溶液和5ug/mL亞酸鈉溶在pH=3模胃條件下采用分光光度法別測定不同濃度的白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除率及亞硝胺生成的阻斷[。結(jié)：酸性條件下，不同濃度的白藜蘆醇對亞硝酸鈉均有較強清除作用，在濃度小0.32時著濃度增大而增大最大達到63.48%同時對亞硝胺生成有較強的阻斷率大到40.94%結(jié)：可修改編輯精選資料白藜蘆醇對亞硝酸鹽有很強的清除能力，對亞硝胺的生成有較強的阻斷能力。關(guān)鍵詞亞硝酸鹽，白藜蘆醇，分光光度法，亞硝胺，清除，阻斷癌癥是當前威脅人類生活的最大殺手,根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年約有500萬左右的人被癌癥奪去生命。在致癌物中,亞硝胺是最令人關(guān)注的一類化學(xué)致癌物質(zhì)亞硝酸鹽作為一種發(fā)色劑和防腐劑2]

在肉制品加工中得到了普遍的應(yīng)用3]

許多蔬菜中天然含有的硝酸鹽在人體內(nèi)通過細菌的作用也可被還原為亞硝酸鹽硝酸鹽是合成亞硝胺的前體之一[4]，人體內(nèi)的這些亞硝酸鹽在一定條件下可以與食物中的仲胺叔胺等形成亞硝胺。N-亞硝基化合物是一種致癌性很強的化合物5]

，已研究的近300種N-亞硝基化合物中，約90%以上具有動致癌性，并證明N-亞基化合物可在體內(nèi)外由前體物胺類與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成[6]

。在體內(nèi)代謝過程中，特別是在胃液中容易形成亞硝胺

因此降低胃內(nèi)的亞硝酸鹽含量及阻斷亞硝胺前提的合成[7]

從而達到防癌抗癌的目的是人類同癌癥斗爭的有效途徑之一，而白藜蘆醇在這方面的研究鮮見報道。白藜蘆醇(resveratrol簡稱Res)是非黃酮類的多酚化合物，日本人Tokaoka1940年首次從毛葉藜蘆的根部分離得到1963等提出白藜蘆醇是某些草藥治療炎癥類代謝紊亂和心臟疾病等的有效成分存在于植物中的天然抗氧化劑葡萄、虎杖等[8]

被列為抗心血管抗癌最有前景的藥物之一。白藜蘆醇具有優(yōu)良的藥理活性和保健功能其市場需求很大且與日劇增目前已有大部分國家和地區(qū)都開發(fā)了白藜蘆醇的相關(guān)保健品和其他產(chǎn)品。中國已將含白藜蘆醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品美國也已把白藜蘆醇作為膳食補充劑本已將從植物提取的白藜蘆醇作為食品添加劑[9]

白藜蘆醇的藥理功能引起了人們的廣泛興趣，因為它涉及到與人體健康密切相關(guān)的許多生理疾病，例如，動脈粥樣化、老年癡呆癥、病毒性肝炎、胃潰瘍、炎癥與過敏反應(yīng)可修改編輯00x0精選資料等。隨著人們對白藜蘆醇的深入研究，已經(jīng)顯示白藜蘆醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎以及預(yù)防食物過敏等作用，可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等領(lǐng)域。所以，對白藜蘆醇的研究及開發(fā)是白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除及阻斷作用具有良好的市場前景及重要的意義。11.1試劑白藜蘆醇（純99%，購于陜西西慈生物技術(shù)有限公司）、蒸餾水、二乙胺鹽酸鹽、二水合檸檬酸三鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二甲胺鹽酸鹽、磷酸二氫鈉（均AR，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、亞硝酸鈉（AR，淮化試劑廠）、無水對氨基苯磺酸（上海山浦化工有限公司）95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠）1.2儀器紫外可見分光光度計UV-5500PC型（上海元析儀器有限公司子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司溫水浴（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司工作臺（蘇州蘇凈有限公司）22.1亞硝酸鈉的清除率的測定亞硝酸鈉在弱酸性的條件下,能與氨基苯磺酸重氮化后,再與N-1-萘乙二胺鹽鹽偶合生成紅色的化合物，本實驗通過測定相同條件下亞硝酸鈉含量的變化來反映白藜蘆醇對亞硝酸根離子的清除能力，并計算清除率：清除率=(A-A)/A×100%可修改編輯0x0x精選資料A—沒有加入白藜蘆醇的亞硝酸鈉溶液空白實驗的吸光度值；A—加入不同濃度白藜蘆醇溶液時的反應(yīng)液的平均吸光度值。溫度37℃在p的條件下，當用相同量的亞硝酸鈉溶液同具有一定濃度梯度的白藜蘆醇溶液反應(yīng)后，再測量吸光度。吸光度越小，溶液中殘存的亞硝酸鈉含量就越小，表明白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除率越高；反之，表明白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除率越低。2.2阻斷亞硝胺合成的原理二甲胺與亞硝酸鈉在37條件下,可適宜地生成二甲基亞硝胺,反應(yīng)式如下:)322

)·NO++H322為)NH+HONO)·+H32322當往白藜蘆醇溶液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時白藜蘆醇優(yōu)先同亞硝酸鈉作用使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應(yīng),達到阻止二甲基亞硝胺生成的目的。據(jù)此可以比較相同條件下生成二甲基亞硝胺量的多少來反映白藜蘆醇阻斷能力的強弱生成二甲基亞硝胺量少,白藜蘆醇的阻斷能力就強,反之則弱紫外光照射下二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根,反應(yīng)式如下:HO+))NH++NO-2323222亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后,再與1-胺偶合生成紅色化合物。用紫外分光光度計測出該紅色化合物的吸光度值可反映出溶液中亞硝酸根離子的含量，亞硝酸根離子的含量可反映出原來溶液中二甲基亞硝胺含量的多少。33.1

溶液的配制可修改編輯222222222222精選資料3.1.10.4%氨基苯酸溶液的配：用分析天平精確稱取對氨基苯磺酸0.4g充分溶解后，定容至100mL。3.1.20.2%酸萘乙胺溶液的配：精確稱取鹽酸萘乙二胺0.2g充分溶解后，定容至100mL。3.1.31-萘胺溶液的配：精確稱取1-萘胺0.1g充分溶解后，定容至100mL。3.1.4濃度為1mmol/L的二甲胺鹽酸溶液的制精確稱取二甲胺鹽酸鹽0.08541g充分溶解后，定容至。3.1.5濃度為1mmol/L亞硝酸溶液的制：確稱取亞硝酸鈉0.069g分溶解后，定容至1000mL3.1.6同濃度白藜蘆溶液的配制精確稱取64mg藜蘆醇，置于燒杯中，加適量95%乙醇溶解，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，配制成0.64mg/mL的白藜蘆醇溶液并標記為7號容量瓶，再分別稀釋配制成0.01mg/mL、、0.04mg/mL0.08mg/mL0.16mg/mL0.32mg/mL白藜蘆醇溶液分別標記為1,2,3,4,5,6號容量瓶，避光保存，備用。3.2NaNO標準液的制備及吸光度的測定12]NaNO標準液制備:天平精確稱取亞硝酸鈉20mg，充分溶解后，定容至得20mg/L的NaNO溶液。然后準確取mg/L的NaNO溶液一1L的容量瓶中并用蒸餾水稀釋容至刻度勻后得到濃度為NaNO標準液

2標準曲線的繪制:分別準確吸取濃度為的NaNO標準液0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.5mL,2.mL置于10mL具塞試管中，并分別編號為0123456，試管。然后分別向各試管中加入0.對氮基苯磺酸mL，搖勻，靜可修改編輯2220x2220x02x2精選資料置35，再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液mL,水稀釋至刻度，搖勻得到濃度分別為0，，0.3ug/mL,0.4ug/mL,0.5ug/mL,0.75ug/mL,1.0ug/mL的NaNO溶液，將所得到的溶液靜置15min后，亞硝酸根離子在nm下存在最大吸收峰，因此本實驗在538nm下測定其吸光度的值，繪制標準曲線。3.3不同濃度的白藜蘆醇溶液在H=3時對亞硝酸鈉的清除率的測定取個10mL具塞試管，分別標記為0，1，，3，456，號試管，依次向各試管中加入5ug/mL的NaNO的溶液1mL然后分別取，，23，，5，67100mL容量瓶中的白藜蘆醇溶液分別依次向0，1，，，，，7具塞試管中順序加入mL,并依次向各試管中分別加入1mLpH=3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液

,之后將個試管置于37℃恒溫水浴槽中反1時。反應(yīng)結(jié)束后，取出試管后立即分別向試管中加入質(zhì)量分數(shù)為0.4%的對氨基苯磺酸溶液各mL,勻靜置35鐘后再向各試管加入質(zhì)量分數(shù)為0.2%酸萘乙二胺溶液各1,搖勻放置5min后,用分光光度計在538nm處分別測出01，234，57試管反應(yīng)液吸光度值A(chǔ)）,其中以加入除白藜蘆醇溶液和亞硝酸鈉溶液外其他所有等量的其他試劑的溶液作為參比溶液，每個濃度配制3個樣品測量吸光度求平均值。根據(jù)下列公式求得白藜蘆醇對亞硝酸根離子的清除率：清除率=(A-A)/A×100%A—沒有加入白藜蘆醇溶液的試管中aNO的吸光度值，即0試管的吸光度值；A—加入不同濃度白藜蘆醇溶液反應(yīng)后試管中aNO的吸光度值。3.4不同濃度的白藜蘆醇溶液在H=3時對亞硝胺合成的阻斷率測定取810mL具塞試管，分別標記為123，567試管。分別取1，2345，7號100mL容量瓶中的白藜蘆醇溶液分別依次向1234，67具塞試管中順序加入0.5mL,然后再依次向各試管中分別加入mLpH=3.0的檸檬酸可修改編輯20x002x22220x002x2222精選資料鈉鹽酸緩沖液,然后依次向各試管加入mmol/mL的N的溶液1mL,向各試管加入1mmol/mL的二甲胺溶液1mL。用蒸餾水將各試管定容刻度為mL將各試管置于37℃恒溫水浴槽中反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，置于紫外分析儀上照15,取出后加1%對氨基苯磺酸溶液1mL,加.1%的1-萘胺1后搖勻放置5min,用分光光度計在525nm處測吸光度值(A),其中以加入除白藜蘆醇溶液和亞硝酸鈉溶液外其他所有試劑的溶液為參比溶液，每個濃度配制3樣品測量吸光度求平均值。根據(jù)下列公式求得白藜蘆醇對亞硝胺合成的阻斷率：阻斷率=(A-A)/A×100%A—沒有加白藜蘆醇溶液試管中aNO的吸光度值，即0號試的吸光度值；A—加入不同濃度的白藜蘆醇溶液后試管中aNO的吸光度值。44.1NaNO溶液的標準曲線的繪制：NaNO標準液在538nm下測定其吸光度的值如表1所示,標準曲線如圖示。從標準曲線可NaNO知在濃度0.1-1ug/mL存在很好的線性關(guān)系，隨著亞硝酸根離子濃度的增大吸光度增大。表1NaNO標準液的吸光度21TheabsorbancestandardsolutionofNaNO2序號

1234567濃度(ug/mL)

0.10.20.30.40.50.751可修改編輯精選資料吸光度A0.0040.0070.0110.0140.0170.0250.0340.040.0350.030.0250.0150.010.0050

NaNO2y=0.0331x+0.0007R2=0.99910

0.20.4NaNO2圖1NaNO標曲線21standardcurveofNaNO2

14.2不同濃度的白藜蘆醇在時對亞硝酸鈉的清除率及對亞硝胺的阻斷率從表2圖2知白藜蘆醇濃度在0.01-0.32mg/mL時對亞硝酸根離子的清除率隨著濃度的增大而增大，對亞硝酸根離子的清除率最大達到63.48%。隨后對亞硝酸根離子的清除率并不再繼續(xù)隨著濃度的增大顯著增加。表2pH=3不同濃度白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除率2TherateofresveratrolatdifferentconcentrationsclearingsodiumnitrateunderPH=3序號白藜蘆醇濃度

012345670（mg/mL）清除率（%）0.00

0.010.020.040.080.160.320.6418.4428.7234.7539.0143.4363.4863.49可修改編輯%2%2精選資料pH=3清除-白藜蘆醇濃度系）（率除清

70605040302010000.10.20.30.40.50.60.7白藜醇濃（）圖2pH=3不同濃度白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除2TheclearingrateofNaNOonresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3從表3圖3知白藜蘆醇濃度在0.01-0.32mg/mL時對亞硝胺的阻斷率隨著濃度的增大而增大，對亞硝胺的阻斷率最大達到40.94%。隨后對亞硝胺的阻斷率并不再繼續(xù)隨著濃度的增大顯著增加。表3時同濃度白藜蘆醇對亞硝胺的阻斷率3TheblockingofnitrosamineresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3序號白藜蘆醇濃度

012345670

0.010.020.040.080.160.320.64（mg/mL）阻斷率（%）0.008.3912.7517.1124.1631.2140.9440.96可修改編輯精選資料圖3不濃白藜蘆醇對亞硝胺的阻斷率3TherateofresveratroldifferentconcentrationsblockingnitrosaminesunderPH=35當溶液環(huán)境為酸性條件時相當于胃液環(huán)境條件下，隨著白藜蘆醇濃度的增大，白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除能力不斷增強白藜蘆醇濃度大約在.32mg/mL時有著63.48%的最大清除率；但是當白藜蘆醇濃度增大到一定程度后，白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除能力不再隨著白藜蘆醇濃度的增大而顯著增加，而是達到一個穩(wěn)定的清除率水平。不同濃度的白藜蘆醇溶液對亞硝胺的生成有一定的阻斷作用，白藜蘆醇濃度約在0.32mg/mL有著40.94%的最大阻斷率但是當白藜蘆醇濃度增大到一定程度后藜蘆醇對亞硝胺的阻斷能力也不再隨著白藜蘆醇濃度的增大而顯著增加，而是達到一個穩(wěn)定的阻斷率水平。結(jié)果表明，白藜蘆醇對人體中的亞硝酸鹽有著良好的清除及阻斷作用。人們應(yīng)充分認識到白藜蘆醇在日常生活中的重要作用，進而為有關(guān)白藜蘆醇的藥品、保健食品的開發(fā)和推廣提供保障?？尚薷木庉嬀x資料短短的兩個月的實驗研究很快就結(jié)束了實驗的成功完成離不開實驗室老師的悉心指導(dǎo)和真誠幫助在此非常感謝張孝林老師的大力支持張老師為我們提供了優(yōu)良的實驗環(huán)境和完備的實驗器材實驗試劑他嚴謹博學(xué)認真以及對科學(xué)執(zhí)著的精神讓我非常感動、更讓我無比的敬佩！參考文獻[1]王廣亞酸偶聯(lián)反應(yīng)及其應(yīng)用于光度法測定亞硝酸根[2]李冬梅.降低肉制品中的亞硝酸鹽含[肉類加工.1997,(3):16-19.[3]譚,莊松娟肉品中亞硝酸鹽國標測定方的探.2005,(7):26-28.[4]曹會蘭.亞硝酸鹽對人體的危害和預(yù)[微量元素與康研,2003,(2):78-80.[5]徐國蔬菜、果N亞硝基化合物致癌的預(yù)防作外醫(yī)衛(wèi)生學(xué)分,1989,(2):93-94.[6]許后效.環(huán)境中的N-硝基化合物北京科出社1988:59-65.[7]褚衍信,馮華進亞酸根清除劑體外研究的新方法及其應(yīng)[J].癥1994,13(5):470-471.[8]李延華,王偉君白蘆醇的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前[J].中國釀造2008.7:10-12.[9]高年發(fā),姜麗等葡酒發(fā)酵過程中白藜蘆醇含量變化的研[J].酒科,[10]趙勞,王曉妮,張海容等.山清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究食與發(fā)酵工業(yè)2006,32(10):29-31.[11]黃翁倪輝琯溪蜜柚果皮提取物抑制亞硝化反應(yīng)的,2007(12):36-39.[12]張葉志汁對亞硝酸鹽清除作用的一墾大學(xué)[13]王.種辛辣蔬菜抗氧性的研.食品與發(fā)酵工業(yè)2001,(5):123-126.[14]勃A有合成（第二北科學(xué)出可修改編輯精選資料Thestudyofresveratrol'sabilityonclearingsodiumnitrateandblockingnitrosamine可修改編輯精選資料YufengLiu,XiaolinZhangSchoolofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,Anhui,ChinaAbstract:Objective:Itistheindicatortostudythedifferentconcentrationsofresveratrolintheacidicenvironmentandalkalineenvironment,clear