噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用研究綜述,漁業(yè)論文

噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用研究綜述,漁業(yè)論文抗體庫(kù)(Antibodylibrary)技術(shù)主要是通過(guò)PCR技術(shù)克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，重組、構(gòu)建到特定的表示出載體中，在原核或真核生物體內(nèi)表示出出具有生物學(xué)功能的抗體分子，并通過(guò)親和挑選獲得特異性抗體。噬菌體抗體庫(kù)(Phageantibodylibrary)技術(shù)是迄今為止發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的制備抗體的技術(shù)，它是一種將PCR技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，并在噬菌體外表表示出、分泌，經(jīng)過(guò)挑選后獲得特異性抗體的技術(shù)。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因中，使外源DNA片段的表示出產(chǎn)物與噬菌體的外殼蛋白融合，展示于噬菌體外表，具有操作簡(jiǎn)單、低成本以及技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在商業(yè)生產(chǎn)中被成功應(yīng)用。當(dāng)前，噬菌體抗體庫(kù)分為Fv、Fab、單鏈抗體(Single-chainantibodyfragment)、單區(qū)抗體(Singledo-mainantibody)和雙鏈抗體(Diabody)等類型。單鏈抗體主要通過(guò)15個(gè)氨基酸序列(Gly4Ser)3linker將重鏈和輕鏈連接起來(lái)，具有體積小、免疫原性低的特點(diǎn)，不易引起人體或動(dòng)物排擠反響。因其無(wú)抗體Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，由于片段分子量較低，能夠有效穿透致密的組織屏障到達(dá)病灶部位，在醫(yī)療診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，成為當(dāng)代生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱門，被以為是21世紀(jì)的陽(yáng)光產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，在養(yǎng)殖病害防治、藥物殘留檢測(cè)、水體水質(zhì)監(jiān)測(cè)以及食品安全控制等方面已經(jīng)有不少報(bào)道。另外，也有學(xué)者將抗體庫(kù)技術(shù)與抗體芯片結(jié)合對(duì)多種水體病原菌進(jìn)行高通量檢測(cè)，為抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。1、噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)病害防控中的研究1．1細(xì)菌性疾病的防治我們國(guó)家是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)品年總量約占世界總量的70%。由于環(huán)境的污染及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)本身的高密度、集約化生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害時(shí)有發(fā)生，每年造成近百億元的經(jīng)濟(jì)損失，華而不實(shí)細(xì)菌性疾病造成的危害和損失尤為嚴(yán)重。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種食源性的病源微生物，廣泛存在于浮游生物及海產(chǎn)品中，不僅能夠引發(fā)海產(chǎn)品的敗血癥，還會(huì)導(dǎo)致人的食物性中毒，引起惡心、嘔吐和腹瀉等腸胃炎疾病。當(dāng)前對(duì)于副溶血弧菌的致病機(jī)理尚不清楚，缺乏有效的預(yù)防與治療手段。三型分泌系統(tǒng)(T3SS)是已經(jīng)知道副溶血弧菌致病的主要因子之一，而T3SS毒力因子的運(yùn)輸管道Needle在其致病經(jīng)過(guò)中起著決定性作用。方遂等通過(guò)Overlap-PCR將VH、Linker和VL組裝成完好的scFv基因，同時(shí)將scFv基因克隆到噬菌體載體pCANTAB-5E上，成功構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體文庫(kù)，測(cè)得該文庫(kù)庫(kù)容量約為1．4107cfu/ml。經(jīng)過(guò)富集、淘洗得到2株驗(yàn)證無(wú)誤的單鏈抗體，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)2株菌株可視為1株單鏈抗體，ELISA檢測(cè)結(jié)果表示清楚所挑選的單鏈抗體具有較高的抗體特異性。由于副溶血弧菌具有多個(gè)治病因子，將挑選到的單鏈抗體與副溶血弧菌的其他致病因子抗體結(jié)合，可制備多功能抗體，控制和治療副溶血弧菌的發(fā)生和擴(kuò)散。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是海水魚(yú)及淡水魚(yú)中的重要致病菌，能夠感染虹鱒、鰻鱺、鱸魚(yú)、黃魚(yú)、石斑魚(yú)等幾十種魚(yú)類，致死率較高，在我們國(guó)家特別流行。夏永娟等成功構(gòu)建了抗鰻弧菌獨(dú)特型單克隆抗體dsFv基因，并使其準(zhǔn)確的在M13噬菌體外表獲得了呈現(xiàn)。通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體能夠與抗原特異性結(jié)合，抗獨(dú)特型抗體能夠模擬抗原表位，能夠作為疫苗使用，而抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體能夠通過(guò)細(xì)菌繁衍大量獲得，降低了疫苗的成本。該dsFv噬菌體有望成為用于預(yù)防魚(yú)類鰻弧菌感染的新一代基因工程疫苗。1．2病毒性疾病的防治草魚(yú)呼腸孤病毒(Reovirusofgrasscarp，GCRV)是我們國(guó)家分離的第1株魚(yú)類病毒，是引起我們國(guó)家草魚(yú)幼魚(yú)出血病大面積爆發(fā)的主要病原體，這種疾病一旦爆發(fā)，其死亡率可高達(dá)85%。陳叢琳等從已構(gòu)建的小鼠天然噬菌體展示抗體文庫(kù)中淘選并獲得了能夠特異性辨別草魚(yú)IgM的單鏈抗體，并在已鑒定的單鏈抗體陽(yáng)性克隆中，挑選出對(duì)草魚(yú)IgM有較好的特異性結(jié)合的單鏈抗體C1B3。結(jié)果表示清楚，相對(duì)于病毒的其他構(gòu)造蛋白而言，VP7在草魚(yú)中能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反響，由此推導(dǎo)VP7應(yīng)是用于疫苗設(shè)計(jì)的首選抗原。該研究通過(guò)單鏈抗體，為草魚(yú)呼腸孤病毒及其他魚(yú)類病原體重組疫苗的研發(fā)提供了重要的分析手段和策略。張曉華等利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量天然噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)成功獲取了能夠辨別GCRVVP7的單鏈抗體，此抗體將成為后面進(jìn)一步研究病毒與細(xì)胞互相作用的有效工具。對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)為已經(jīng)知道基因組最大的動(dòng)物病毒，嚴(yán)重危害水生甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。王曉潔等從抗WSSV單抗的細(xì)胞株中，采用間接熒光檢測(cè)法挑選出8株分泌較強(qiáng)的抗WSSV單抗的細(xì)胞株，可用于白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的研制。試驗(yàn)采用雙抗夾心免疫層析法，制成快速檢測(cè)、診斷WSSV的試紙條，整個(gè)反響只需5min，與以前檢測(cè)WSSV較快的斑點(diǎn)免疫印跡法需要3h相比，在很大程度上提高了檢測(cè)速度。白斑綜合癥病毒檢測(cè)試紙條是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、合適于現(xiàn)場(chǎng)使用的WSSV檢測(cè)、診斷試紙條，且無(wú)假陽(yáng)性。此試紙條尤其適于養(yǎng)殖人員現(xiàn)場(chǎng)、時(shí)事跟蹤、監(jiān)控、檢測(cè)，可為白斑癥的預(yù)防提供可靠的監(jiān)測(cè)根據(jù)。2、噬菌體抗體庫(kù)在水環(huán)境監(jiān)控的研究2．1藥物殘留檢測(cè)當(dāng)前，用化學(xué)藥物和抗生素治療魚(yú)類細(xì)菌性疾病是常用且較為有效的方式方法，但同時(shí)具有很多弊端，如藥物和抗生素在水產(chǎn)品中的殘留、病原生物耐藥性加強(qiáng)、水域生態(tài)污染等。在尋求病害防治的其他方式方法時(shí)，傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)獲得的抗體不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且制備經(jīng)過(guò)較為復(fù)雜，無(wú)法知足高通量的需要，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)獲得的抗體具有簡(jiǎn)單、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)?；前奉愃幬?Sulfonamides，SAs)為化學(xué)合成抗菌藥，由于其具有廣譜抗菌活性，且價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學(xué)和動(dòng)物的感染性疾病防治中具有重要地位，但不合理的使用容易引起過(guò)敏反響，造成耐藥菌增加，且動(dòng)物性食品中殘留的藥物可能對(duì)人們的健康造成潛在的危害。趙琳等成功構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫(kù)，最終得到的庫(kù)容量約為5．67107cfu/ml。在這里抗體庫(kù)的基礎(chǔ)上，閆曉敏等以偶聯(lián)卵血清蛋白的磺胺甲氧嗦(OVA-SMP)和磺胺甲惡哇(OVA-SMZ)為固相包被抗原，挑選并獲得了特異性較強(qiáng)的Fab抗體。王輝等成功建立了斑點(diǎn)叉尾蛔單鏈抗體(ScFv)抗體庫(kù)，并測(cè)定其庫(kù)容為5．8105cfu/ml。以O(shè)VA-SMZ為包被抗原，挑選到針對(duì)OVA-SMZ的抗體。2．2水質(zhì)監(jiān)測(cè)在養(yǎng)殖經(jīng)過(guò)中，投入過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、大量施肥和投餌等可導(dǎo)致水體中的氮、磷超標(biāo)，進(jìn)而引起藻類和浮游生物過(guò)度繁衍，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖的成活率。微囊藻素是從藍(lán)藻水華中分離出來(lái)的多肽毒素，能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和水體環(huán)境的危害比擬嚴(yán)重。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道微囊毒素對(duì)魚(yú)類的危害，微囊毒素主要危害魚(yú)類鰓、肝、腎、消化器官、循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等。Zhao等利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)以微囊藻毒素為包被抗原，從構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中成功挑選到特異性目的抗體，得到的目的抗體能夠快速簡(jiǎn)單地對(duì)水體中微囊藻素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在水體水質(zhì)檢測(cè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。3、噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)品安全控制的研究長(zhǎng)久以來(lái)，河豚魚(yú)被以為是東亞以及東南亞居民餐桌上一道美味的魚(yú)類食物，但由于河豚毒素有劇毒，因而每年都會(huì)發(fā)生30～50例河豚魚(yú)中毒的事件。河豚毒素(Tetrodo-toxin，TTX)是河豚魚(yú)中最主要的一種毒素成分。劉立才等成功構(gòu)建抗河豚毒素(TTX)的重組的單鏈抗體(scFv)展示文庫(kù)，庫(kù)容量為1．5106cfu/ml，經(jīng)過(guò)6輪的淘選經(jīng)過(guò)，獲得了與河豚毒素特異性結(jié)合的抗體，該抗體庫(kù)的構(gòu)建為快速檢測(cè)河豚毒素提供了基礎(chǔ)。在熱帶和亞熱帶海域珊瑚礁的附近，有400多種魚(yú)因食用毒藻類而被毒化，華而不實(shí)包括梭魚(yú)、黑鱸和真鯛等重要海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，這些魚(yú)類統(tǒng)稱為雪卡魚(yú)。這些雪卡魚(yú)體內(nèi)都含有雪卡毒素，是一種可引起人類中毒的珊瑚魚(yú)毒素，毒性極強(qiáng)，比河豚毒素的毒性強(qiáng)20倍。雪卡毒素主要存在于肌肉、內(nèi)臟和生殖腺中，可引發(fā)神經(jīng)性中毒。Nagumo等通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成功挑選出抗雪卡魚(yú)毒素的特異性抗體，為今后雪卡魚(yú)毒素的研究及其檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。4、噬菌體抗體庫(kù)與抗體芯片結(jié)合的研究抗體芯片(Antibodymicroarrays)是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，又稱抗體微陣列，具有高特異性、高靈敏性、高通量及多樣品或多指標(biāo)平行分析的優(yōu)點(diǎn)，是免疫學(xué)研究的一種新技術(shù)，已被應(yīng)用到很多領(lǐng)域。王欣欣等用抗體芯片成功的對(duì)海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、延遲緩慢愛(ài)德華氏菌(Ed-wardsiellabacterium)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、海洋分支桿菌(Nontuberculoausmycobacteria)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、海洋分支桿菌(Nontuberculoausmycobacteria)等6種細(xì)菌進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測(cè)。在這里試驗(yàn)中，應(yīng)用硫酸銨分級(jí)沉淀法進(jìn)行兔抗血清的純化，這能有效去除免疫血清中的非特異性抗體和雜蛋白，降低兔抗血清的非特異性吸附，進(jìn)而使其與其他菌株的穿插反響降到最低。通過(guò)ELISA對(duì)6種細(xì)菌與各菌株兔抗血清之間的穿插反響，分析發(fā)現(xiàn)純化后穿插反響明顯減小，用吸附純化后的抗體構(gòu)建的病原菌檢測(cè)抗體芯片的特異性顯著加強(qiáng)，因而可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。廖瑋等利用pⅧ展示系統(tǒng)成功改良噬菌體抗體芯片，由于pⅧN端有多個(gè)帶電氨基酸，會(huì)增加非特異性吸附，這些帶電氨基酸會(huì)被陽(yáng)性噬菌體上的融合抗體分子屏蔽，減少對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，進(jìn)而降低了背景。降低pⅧ的非特異吸附，不僅能夠提高芯片的靈敏度，而且能夠降低非特異結(jié)合的背景，提高淘選效率，大幅度提高了噬菌體抗體芯片的靈敏度和信噪比，同時(shí)可為抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新途徑。5、瞻望綜上所述，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)展現(xiàn)出了宏大的應(yīng)用前景，已成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等問(wèn)題的重要手段。同時(shí)隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的日益發(fā)展，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也具有廣闊的前景。但是，由于抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)