降鈣素基因相關(guān)肽與運(yùn)動(dòng)性疲勞的潛在關(guān)系,運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)論文

降鈣素基因相關(guān)肽與運(yùn)動(dòng)性疲勞的潛在關(guān)系,運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)論文原標(biāo)題：降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲憊的影響內(nèi)容摘要：目的：討論降鈣素基因相關(guān)肽〔CGRP〕對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲憊的影響。方式方法：成年健康雄性SD大鼠，根據(jù)不同的預(yù)處理措施隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、磷酸鹽緩沖液〔PBS〕預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組、辣椒素〔CAP〕預(yù)處理組、CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組，各組動(dòng)物在平靜狀態(tài)時(shí)、運(yùn)動(dòng)80min時(shí)和運(yùn)動(dòng)至力竭后即刻處死。然后用免疫組化和放射免疫方式方法檢測(cè)上述條件下大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表示出變化；用蘇木精-伊紅〔HE〕染色觀察上述條件下運(yùn)動(dòng)性疲憊大鼠骨骼肌形態(tài)構(gòu)造的變化；用化學(xué)比色的方式方法檢測(cè)上述條件下骨骼肌超氧化物歧化酶〔SOD〕、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶〔GSH-PX〕、過(guò)氧化氫酶〔CAT〕及丙二醛〔MDA〕的變化。結(jié)果：1〕給予CGRP預(yù)處理后，大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯縮短〔P0.05〕，而給予CAP預(yù)處理后大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯延長(zhǎng)〔P0.05〕；2〕CGRP免疫組織化學(xué)和放射免疫結(jié)果顯示，CGRP的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在肌纖維縱切面上，其形狀為橢圓形或棒狀，主要分布于肌纖維膜的外表。給予CGRP預(yù)處理后，大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表示出明顯升高〔P0.05〕，而給予CAP預(yù)處理后，大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表示出明顯下降〔P0.05〕；3〕HE染色顯示，平靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)構(gòu)造未見(jiàn)明顯改變；與平靜狀態(tài)相比，運(yùn)動(dòng)80min時(shí)除CGRP預(yù)處理組骨骼肌的細(xì)胞核明顯增加、增大外，其余各組均無(wú)明顯改變；力竭運(yùn)動(dòng)后即刻與平靜狀態(tài)下相比，除CAP預(yù)處理組無(wú)明顯改變外，其余各組骨骼肌的細(xì)胞核均明顯增加、增大；4〕化學(xué)比色結(jié)果顯示，給予CGRP預(yù)處理后，大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明顯下降〔P0.05〕，MDA的含量明顯上升〔P0.05〕，而給予CAP預(yù)處理后大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明顯上升〔P0.05〕，MDA的含量明顯下降〔P0.05〕。結(jié)論：CGRP加劇了運(yùn)動(dòng)性疲憊的產(chǎn)生。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：降鈣素基因相關(guān)肽；運(yùn)動(dòng)性疲憊；骨骼??；自由基運(yùn)動(dòng)性疲憊是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激所產(chǎn)生的一系列綜合性復(fù)雜反響，易導(dǎo)致骨骼肌系統(tǒng)損傷，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功能障礙，機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力下降[7,19,28,32].運(yùn)動(dòng)性疲憊的產(chǎn)生不僅與中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒(méi)有足夠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元驅(qū)動(dòng)有關(guān)，而且與神經(jīng)肌肉接頭傳遞的失敗及周?chē)∪獯x水平的改變有關(guān)。因而，神經(jīng)肌肉接頭是運(yùn)動(dòng)性疲憊在外周產(chǎn)生的一個(gè)重要位點(diǎn)。當(dāng)前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)性疲憊與神經(jīng)肌肉接頭的研究主要集中于突觸前和突觸后[27,31].在突觸前其可能存在的機(jī)制有：Ca2+內(nèi)流的下降；Ca2+對(duì)神經(jīng)末梢囊泡釋放敏感性的下降；可利用的囊泡數(shù)量下降。在突觸后其可能存在的機(jī)制有：乙酰膽堿受體〔AChR〕的脫敏；肌纖維膜興奮性的下降。自從在腦、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢檢測(cè)出降鈣素基因相關(guān)肽〔calcitoningene-relatedpeptide,CGRP〕后，CGRP在神經(jīng)肌肉接頭作為一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)和/或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑就被廣泛研究[5,10,20,25].CGRP被輸送到神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)末梢后儲(chǔ)存在致密核心小泡〔LDCV〕[6,15],以Ca2+依靠方式伴隨神經(jīng)刺激而釋放[10,22,30],進(jìn)而影響肌肉的代謝、構(gòu)造和功能特征。因而，CGRP的變化將導(dǎo)致該神經(jīng)所支配骨骼肌的代謝、構(gòu)造和功能特征的改變[24].研究表示清楚，CGRP有雙重效應(yīng),正常生理?xiàng)l件下CGRP的釋放對(duì)靶組織起營(yíng)養(yǎng)作用，能夠擴(kuò)張周?chē)?，促進(jìn)AChR的合成，并對(duì)睪丸下降、胃腸活動(dòng)、胃酸分泌等有良好的成效，并能抑制活性氧自由基的產(chǎn)生和緩減組織的氧化應(yīng)激，對(duì)組織起內(nèi)源性的保衛(wèi)作用，然而，在應(yīng)激或病理?xiàng)l件下，CGRP也能直接或間接的導(dǎo)致脊髓、骨骼肌興奮性的改變和炎癥的發(fā)生，對(duì)組織造成損傷[12,17].有關(guān)CGRP與運(yùn)動(dòng)性疲憊的關(guān)系，Homonko等和Theriault〔1997〕等的研究表示清楚，一次性大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CGRP顯著提高[13];另有研究表示清楚，在運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)中骨骼肌CGRP的改變與運(yùn)動(dòng)和/或骨骼肌的缺血缺氧有關(guān)[4],這提示，CGRP可能與運(yùn)動(dòng)性疲憊的產(chǎn)生有關(guān)，但CGRP在運(yùn)動(dòng)性疲憊大鼠神經(jīng)肌肉接頭的生理和生物學(xué)角色當(dāng)前仍不清楚。本研究通過(guò)一次性運(yùn)動(dòng)至力竭疲憊動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組化、放射免疫、蘇木精-伊紅〔hematoxylin-eosin,HE〕染色和化學(xué)比色的方式方法并結(jié)合補(bǔ)充外源性的CGRP和皮下注射CGRP耗竭劑的方式方法檢測(cè)CGRP對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間、骨骼肌的形態(tài)構(gòu)造、酶的活性和自由基代謝的影響，探尋求索CGRP與運(yùn)動(dòng)性疲憊之間的潛在關(guān)系。1材料和方式方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑成年健康雄性SD大鼠150只，體重200~250g,購(gòu)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，所有動(dòng)物經(jīng)一般體查均無(wú)異常。所有大鼠都置于同一動(dòng)物房，分籠飼養(yǎng)，室溫16~22℃，相對(duì)濕度45%~55%,正常晝夜節(jié)律，自由飲食。CGRP、辣椒素和多克隆兔抗CGRP抗體均購(gòu)于Sigma公司，骨骼肌超氧化物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶〔glutathioneperoxidase,GSH-PX〕、過(guò)氧化氫酶〔catalase,CAT〕及丙二醛〔malondialdehyde,MDA〕均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，CGRP放射免疫試劑盒購(gòu)于北京東亞放免技術(shù)研究所。1.2動(dòng)物模型制備動(dòng)物模型的制備根據(jù)Bedford[3]所建立的疲憊運(yùn)動(dòng)模型，采用一次性大強(qiáng)度電動(dòng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭的方式，即水平跑速為28m/min〔超過(guò)90%VO2max〕，運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)給予大鼠機(jī)械刺激后，大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng)，下跑臺(tái)后伏地喘息，暫時(shí)無(wú)逃避反響。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，大鼠天天進(jìn)行一次適應(yīng)性低強(qiáng)度〔跑臺(tái)坡度為0，速度10m/min,持續(xù)時(shí)間為10min〕跑臺(tái)訓(xùn)練，共訓(xùn)練3天，然后進(jìn)行一次預(yù)備的力竭性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，根據(jù)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間剔除運(yùn)動(dòng)能力太差和運(yùn)動(dòng)能力太強(qiáng)的大鼠后隨機(jī)分組，休息10天后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將150只大鼠根據(jù)不同的預(yù)處理措施隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組、CAP預(yù)處理組、CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組，各組大鼠在平靜狀態(tài)時(shí)、運(yùn)動(dòng)80min時(shí)和運(yùn)動(dòng)至力竭后即刻處死。1.4PBS、CGRP和CAP的預(yù)處理大鼠皮下注射PBS、CAP、純化的大鼠CGRP.PBS預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組和CAP預(yù)處理組于力竭運(yùn)動(dòng)前4天兩次皮下給予PBS〔每次300l〕、CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕和CAP〔每次50mg/kg,溶于10%無(wú)水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中〕。CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組于力竭運(yùn)動(dòng)前8天的前1~4天兩次皮下給予CAP〔每次50mg/kg,溶于10%無(wú)水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中〕，后5~8天兩次皮下給予CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕。1.5組織制備各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛〔4ml/kg〕，待麻醉后快速取左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭，除去外表的凝血及結(jié)締組織，經(jīng)冰冷生理鹽水洗滌幾次，用濾紙吸干水分，用做放射免疫分析的標(biāo)本放入1ml0.1M冰醋酸在手動(dòng)勻漿管中冰浴勻漿研磨，用做酶活性和自由基檢測(cè)的標(biāo)本按1g組織中參加10mL冰鹽水的比例作為勻漿介質(zhì)在手動(dòng)勻漿管中稀釋?zhuān)驖{研磨，再經(jīng)4℃3000r/min離心10min,取上清液儲(chǔ)存于-20℃冰箱保存待測(cè)。用作免疫組織化學(xué)染色和HE染色的組織，在上述大鼠麻醉快速取下左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭后，開(kāi)胸經(jīng)左心室插管入升主動(dòng)脈，先灌以生理鹽水〔150ml〕，繼之以4%多聚甲醛磷酸緩沖液〔500ml,pH7.4,4℃〕灌注固定，先快后慢。取右側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭，剔除筋膜，入一樣的灌注液4℃后固定過(guò)夜，0.01MPBS充分洗滌后，OCT包埋于-80℃保存?zhèn)溆谩?.6CGRP免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本于-80℃冰箱取出后，-20℃三頓恒低溫切片機(jī)切片，片厚200m,進(jìn)行CGRP免疫組織化學(xué)染色，采用漂浮法，主要經(jīng)過(guò)如下：1〕切片用0.01MPBS〔pH7.4〕振動(dòng)漂洗3次，每次10min;2〕入含0.3%的甲醇雙氧水，20min;3〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動(dòng)漂洗3次，每次10min;4〕入5%正常小牛血清白蛋白〔BSA〕室溫封閉2h;5〕入1∶1000的多克隆兔抗CGRP抗體〔Sigma〕4℃孵育過(guò)3夜；6〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動(dòng)漂洗3次，每次10min;7〕入1∶200生物素化山羊抗兔IgG〔Vector〕37℃孵育2h;8〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動(dòng)漂洗3次，每次10min;9〕入1∶200ABC復(fù)合物〔Vector,預(yù)先30min配制〕，37℃2h;10〕入0.05%DAB+0.03%雙氧水顯色，0.01MPBS終止反響、貼片、常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照采用正常小牛血清代替一抗，其余步驟與上述一樣，結(jié)果為陰性。1.7骨骼肌CGRP濃度的測(cè)定測(cè)定時(shí)用0.1M的PBS5倍稀釋。按要求依次加樣后，充分混勻，室溫放置20min后，4℃3000rpm離心25min,取上清液，在計(jì)數(shù)器上測(cè)定CPM數(shù)。通過(guò)預(yù)先編制的程序，直接給出CGRP濃度。1.8HE染色標(biāo)本于-80℃冰箱取出后，0.01MPBS充分洗滌后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚4m.HE染色按以下步驟進(jìn)行：常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水后行HE染色。蘇木精液染色6min,流水沖洗，1%鹽酸處理3s,稍水洗，1%氨水返藍(lán)5s,流水沖洗，0.5%伊紅液染色3min,稍水洗，80%、90%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。1.9SOD、GSH-PX、CAT活性測(cè)定及MDA含量測(cè)定SOD、GSH-PX、CAT的活性及MDA的含量測(cè)定采用比色法，組織蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。詳細(xì)操作如下：1〕取樣品參加干凈試管中，依次參加各試劑，混勻，95℃或37℃水浴，參加中止液；2〕蒸餾水調(diào)零，測(cè)定吸光度OD值；3〕空白管用蒸餾水代替樣品，標(biāo)準(zhǔn)管用標(biāo)準(zhǔn)液代替樣品，其他步驟一樣；4〕根據(jù)樣品、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管在分光光度計(jì)