骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定,醫(yī)學工程論文

骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定,醫(yī)學工程論文為探尋求索一種簡便有效的方式方法，本研究采用全骨髓貼壁法對骨髓間充質(zhì)干細胞〔BMSCs〕進行分離培養(yǎng)及初步鑒定，以使其更好地服務(wù)于臨床應用。本研究通過全骨髓分離法獲得大鼠BMSCs,化學藥物〔-ME〕誘導BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞，從細胞的強增殖能力、細胞的外表標記物及分化潛能3方面對分離培養(yǎng)的細胞進行了鑒定，在長時間的未進行換液的體外細胞培養(yǎng)經(jīng)過中發(fā)現(xiàn)BMSCs可能存在自分化現(xiàn)象，筆者以為，自分化對于BMSCs的臨床治療機制的研究極為重要。當前，國內(nèi)學者對BMSCs的研究牽涉較少。1材料與方式方法1.1實驗動物清潔級2周齡雄性大鼠一只〔體質(zhì)量75g,由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供〕.1.2試劑DMEM/F12和胎牛血清；胰蛋白酶；兔抗大鼠FITC-CD29、PE-CD90單克隆抗體；兔抗大鼠Nse單克隆抗體，SABC免疫組化試劑盒〔北京欣博盛生物科技有限公司〕.1.3BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代大鼠斷頸處死，無菌分離四肢長骨，暴露骨髓腔，用注射器汲取無血清培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心〔800r/min6min〕,棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)后以109/ml密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，記P0,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液，以后每3天換液一次。至10~13d左右，貼壁細胞80%~90%匯合時，0.125%胰酶消化，約1~2min,1傳2,記P1,以此類推，利用BMSCs易消化的特點到達純化目的，須嚴格控制酶的量和消化時間。每次傳代用新培養(yǎng)瓶，以棄去貼壁非常牢固的細胞，通太多次傳代對細胞進行純化。1.4形態(tài)學觀察用倒置顯微鏡觀察并拍照1.5BMSCs細胞表型鑒定取生長良好的P3代細胞，制成細胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min,10%BSA封閉30min,將適度稀釋的熒光標記的單克隆抗體FITC-CD29、PE-CD90分別參加不同的切片上4℃過夜，熒光顯微鏡下觀察熒光分布，拍照。1.6BMSCs定向誘導分化取同一批P3代細胞，制成細胞爬片，適當培養(yǎng)待貼壁后分為對照組和誘導劑組。誘導劑組采用1mmol/L-ME的10%FBS低糖DMEM預誘導，24h后用含2mmol/L-ME無血清低糖DMEM誘導6h,對照組中不加誘導劑，一直培養(yǎng)。1.7神經(jīng)元樣細胞的免疫組化鑒定采用SABC免疫組化法，用4%多聚甲醛固定30min,0.1%TritonX-100透膜30min,3%H2O2/甲醇消除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉血清孵育20min,將一抗〔兔抗大鼠Nse〕按適當比例加于玻片上，4℃濕盒內(nèi)過夜，次日加生物素化二抗后37℃下孵育30min,加SABC,DAB顯色，蘇木素復染，觀察，拍照，以PBS代替一抗作陰性對照。2結(jié)果2.1倒置顯微鏡觀察原代分離的細胞大小均一、圓形、折光性強，懸浮，紅細胞居多；48h后可見部分細胞貼壁，成短梭形；4~5d開場快速增殖；培養(yǎng)8~10d后細胞漸鋪滿培養(yǎng)瓶，成長梭形，漩渦狀生長〔圖A〕,此時結(jié)束原代培養(yǎng)，進行傳代擴增，以去除結(jié)節(jié)狀分布的小圓形細胞〔圖B〕和長梭形的貼壁性強的成纖維樣細胞〔圖C〕.傳代培養(yǎng)的細胞3~4h即貼壁，細胞增殖后以梭形為主，排列有明顯方向性〔圖D-F〕.不添加任何生長因子，細胞傳5~6代左右，老化現(xiàn)象嚴重。2.2BMSCs表型鑒定P3代細胞免疫熒光顯示BMSC的外表標記物CD29、CD90陽性〔圖G-H〕.2.3BMSCs的神經(jīng)元誘導結(jié)果倒置顯微鏡觀察，BMSCs在1h左右開場，即發(fā)生形態(tài)變化，扁平、梭形的細胞胞漿回縮，向核集中，1~3d后出現(xiàn)多個延長的胞體突起，類似于神經(jīng)元樣細胞的假足〔圖I〕;而空白組始終未變化〔圖J〕.免疫細胞化學染色顯示，實驗組神經(jīng)元樣細胞的胞體及部分突起成棕黃色，Nse陽性表示出〔圖K-M〕;與誘導組同時間點的空白組幾乎全為陰性〔圖N〕.2.4未加任何誘導劑組空白組培養(yǎng)30d左右時BMSCs的自分化觀察，可見神經(jīng)樣細胞和圓形透亮的凋亡細胞?！矆DO-Q〕。3討論BMSCs是骨髓中除造血干細胞以外的非造血性干細胞，正常時只要極少數(shù)在增殖期，在骨髓中的豐度很低，約占骨髓有核細胞的0.001%~0.01%,但取材方便，易于體外分離和擴增，具有多向分化的潛能.當前獲取BMSCs的方式方法主要有貼壁挑選法、密度梯度離心法、流式細胞分選法、免疫磁珠法4種.本實驗通過全骨髓貼壁法，利用細胞不同的貼壁特性，隨傳代完成對BMSCs的純化，并通過誘導證實了其分化能力，為今后進一步的研究和應用奠定了基礎(chǔ)。干細胞是一類具有多向分化潛能和自我復制能力的尚未分化的原始細胞，具有經(jīng)培養(yǎng)不定期的分化并產(chǎn)生特化細胞的能力，根據(jù)來源不同可分為造血干細胞、神經(jīng)干細胞和間充質(zhì)干細胞等。間充質(zhì)干細胞廣泛存在于機體的多種組織〔骨髓、臍帶血、脂肪組織等〕中，BMSCs是骨髓中胚層未分化的間充質(zhì)干細胞，正常時只要極少數(shù)處于增殖期，在骨髓中的豐度很低，約占骨髓細胞總數(shù)的0.001%~0.1%,是由形態(tài)、增殖能力及分化潛能各不一樣的不同亞型的異型性細胞群構(gòu)成.由于當前尚缺乏特異的干細胞標記物，也難以通過分化或增殖能力的不同，將一種亞型同另一種亞型區(qū)分開來，因而無統(tǒng)一的獲取高純度BMSCs的方式方法。對于BMSCs的體外分離培養(yǎng)主要有下面4種：密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、流式細胞分選法、免疫磁珠法?！?〕密度梯度離心法利用骨髓細胞成分的比重不同采用細胞分離液有效的將骨髓細胞分層且對細胞活性影響小，但缺點在于毀壞BMSCs相應的微環(huán)境，丟失大量可能促進BMSCs生長的細胞因子；〔2〕免疫磁珠法和流式細胞儀挑選技術(shù)法在分選經(jīng)過中，對細胞的活性影響十分大，可導致提取的細胞活性喪失、增殖能力消失，而且消耗損費宏大，因而應用也普遍較少；〔3〕全骨髓貼壁法作為一種簡單、經(jīng)濟、高效的方式方法，被越來越多的應用.研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs介入構(gòu)成造血干細胞的生存和分化的微環(huán)境，通過分泌細胞外基質(zhì)成分對造血干細胞的分化成熟進行調(diào)控，體外培養(yǎng)條件下可跨胚層多向分化，具有很強的可塑性.當前大多數(shù)實驗室通過BMSCs不表示出造血干細胞標記物CD14、CD34、CD11b和白細胞外表標記物CD45,而表示出CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等標記物進行初步鑒定；階段特異性胚胎干細胞抗原-4〔SSEA-4〕和神經(jīng)節(jié)苷酯〔Ganglioside〕可用于準確鑒定BMSCs,以及如今正在研制的用特異性單克隆抗體分離BMSCs類群。與胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞相比，BMSCs有著難以比較的優(yōu)勢:〔1〕取材、移植方便、安全、損傷小、來源豐富，骨髓穿刺便可獲得；〔2〕短期內(nèi)可大量擴增：體外培養(yǎng)時，起始生長速度緩慢，約6~7d開場，增長速度明顯加快；〔3〕低免疫原型：因細胞處于原始狀態(tài)，不易被辨別，所以不存在免疫排擠的特性，沒有血型匹配問題；〔4〕具有較強的分化潛能、可塑性和跨胚層分化能力，其分化表現(xiàn)出明顯的組織特異性，BMSCs所到達的組織微環(huán)境決定其分化方向；〔5〕歸巢性：損傷信號能夠刺激干細胞向受損器官、組織遷移分化，能夠歸巢到受損病灶，對受損的細胞進行修復；〔6〕易被外源基因轉(zhuǎn)染并且能高效、穩(wěn)定表示出多種治療性外源基因；〔7〕能在宿主體內(nèi)長期存活。本實驗采取的全骨髓貼壁法主要是通過利用BMSCs貼壁而造血干細胞懸浮的方式方法以及BMSCs與成纖維細胞等貼壁細胞對胰酶消化反響〔包括胰酶的用量和消化時間〕的不同，利用消化的時間差，并通過傳代，到達分離純化BMSCs的目的，華而不實BMSCs較成纖維細胞，單核細胞更易被消化，此法操作簡單，對細胞微環(huán)境和細胞活性影響都很小，使其易于保持在類似于骨髓內(nèi)生長時的微環(huán)境，經(jīng)過2~3次傳代，便可得到相對純化的BMSCs.在整個機械分離大鼠骨髓的經(jīng)過中，應注意嚴格的無菌操作，在剝離皮膚、游離四肢肌肉及分離骨髓的各個經(jīng)過完成后，要注意及時更換無菌器械，不能存在僥幸心理，避免污染。另外，由于BMSCs生長時的密度依靠性，在傳代時應注意適當?shù)谋壤?，?傳2為宜，在傳代經(jīng)過中一定要注意消化時間，以消化1~2min,梭形細胞變圓時加含血清培養(yǎng)液終止消化為宜，切忌消化時間過久。實驗發(fā)現(xiàn)盡管BMSCs具有向神經(jīng)元樣細胞分化的能力，但誘導體系和培養(yǎng)體系仍需改善，由于細胞培養(yǎng)經(jīng)過中存在不同程度老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為本來梭形的細胞呈寬大的噗狀，細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和顆粒。誘導后構(gòu)成的細胞由于一些原因尚無法在功能上進一步確定能否為神經(jīng)元細胞，所以只能暫時稱之為神經(jīng)元樣細胞。本實驗最主要的意義是在一定程度上證明了BMSCs在無誘導條件下發(fā)生了自分化現(xiàn)象構(gòu)成了神經(jīng)元樣細胞，由于對細胞本身的干涉很少，使得后續(xù)研究的精到準確性得以保證。以往的研究和本實驗均表示清楚，在特定的誘導條件下BMSCs能夠分化為神經(jīng)元樣細胞。BMSCs移植已開場在臨床上用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，獲得了相對不錯的效果,但是對治療機制尚不特別清楚，研究發(fā)現(xiàn)移植后的BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的比例較低，以為可能是通過其分泌營養(yǎng)因子、生成血管、釋放激素和抑制炎性反響來發(fā)揮治療作用，而并非發(fā)生真正意義上的細胞取代.既然這樣，筆者以為能夠另辟思路，去繁就簡，先去掉藥物誘導這一環(huán)節(jié)，通過分析比擬BMSCs的直接移植和自分化為神經(jīng)樣細胞后再移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果，這樣可排除藥物誘導對BMSCs的相應基因表示出的干擾，使機制或通路的研究盡可能簡單，以便進一步說明，而一旦確定相應治療機制后，再通過藥物誘導，熒光定量PCR技術(shù)和Western技術(shù)分析通路中相關(guān)基因和蛋白分子水平的改變。與傳統(tǒng)的直接藥物誘導比擬，這樣可大大提高有效誘導藥物的挑選和藥物有效成分提取的效率，避免不必要的研究。為了盡可能減少眾多因素對BMSCs的干擾，其自分化就顯得至關(guān)重要。本實驗在形態(tài)學上初步證明了BMSCs在10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，5%CO2,37℃培養(yǎng)條件時，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30d左右時，可見明顯的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)的細胞，與此同時其余的細胞均發(fā)生凋亡并逐步消失〔圖o-q〕,但是自分化后構(gòu)成的神經(jīng)元樣細胞的數(shù)目少，單個分布，無法進行下一步的表型鑒定和相關(guān)的細胞電生理功能研究，這一缺陷應該能夠通過接種75cm