對氧磷酯酶亞型1對小鼠巨噬細胞的作用機制,病理學論文

對氧磷酯酶亞型1對小鼠巨噬細胞的作用機制,病理學論文對氧磷酯酶(Paraoxonase,PON)是一類鈣依靠性的催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶,因其常見底物為對氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三種亞型,華而不實PON1主要由肝臟合成分泌入血、高親和結合于高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL),是HDL發(fā)揮抗氧化及抗炎的主要成分。大量流行病學調查表示清楚,人群中可因PON1基因多態(tài)性、衰老、冠心病、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病因素出現(xiàn)血清PON1活性降低,我們前期的調研也以為,血清低PON1活性可作為評估冠心病事件發(fā)生及嚴重程度的一種危險標志。一系列實驗研究也證實,PON1具有抗動脈粥樣硬化的作用:PON1基因敲除(PON1geneknockout,PON1-/-)小鼠可觀察到體內HDL更容易氧化,低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)氧化明顯增加,高脂條件下更易導致動脈粥樣斑塊構成;在apoE基因敲除小鼠中高表示出PON1,HDL抗氧化能力加強,可有效減緩粥樣斑塊的發(fā)展;細胞實驗也發(fā)現(xiàn),PON1轉基因或高表示出可降低巨噬細胞過氧化物水平,顯著抑制炎癥因子腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-,TNF-)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的合成和分泌,明顯改善巨噬細胞的炎癥氧化狀態(tài)。盡管PON1確切的作用底物及相關機制仍未徹底說明,但其抗炎抗氧化活性顯然對于抗動脈粥樣硬化效應有重要意義。因而,本研究擬構建含人源性PON1基因的慢病毒載體,旨在真核細胞高效表示出分泌PON1,為進一步研究PON1的生理性底物、相關代謝性疾病的發(fā)生機制及臨床診治奠定基礎。1材料與方式方法1.1主要材料與試劑人胚腎上皮293T細胞購于武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心;pWPI-GFP慢病毒表示出載體受贈于美國SouthCarolina大學醫(yī)學院樊大平博士;來源于人肝cDNA文庫含PON1的pUC載體購于Genecopoeia公司;質粒提取試劑盒購于TIANGEN公司;LB培養(yǎng)基為OXOID公司產品;PCR相關試劑為Takara公司產品;DNA凝膠純化回收試劑盒購于Axygen公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清購自Gibco公司;對氧磷(paraox-on)、巰基乙酸鹽肉湯(thioglycollatebroth)為Sigma公司試劑;LDL購于ProSpec-Tany公司;蛋白Marker、核酸Marker、磷酸鈣轉染試劑盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液購于碧云天生物技術研究所;PON1抗體、羊抗小鼠IgG為Abcam公司產品;ECL化學顯影液購于Thermo公司;TNF-、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于eBioscience公司;其它試劑均為進口分裝或國產分析純。1.2方式方法1.2.1pWPI-PON1重組載體的構建根據慢病毒載體圖譜及購買的pUC19質粒中PON1序列,設計定點突變PCR的特異寡核苷酸引物,即于目的基因的5端添加上PmeⅠ酶切位點,上游引物5-TACGTTTAAACTCCCCGACCATGGCGAAG-3,下游引物5-GGCGGCGTTTAAACTTAGAGCT-CACAGTAA-3(下劃線標記處為PmeⅠ酶切位點),引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴增長度為1068bp。PCR條件(95℃變性,55℃退火,72℃延伸)PCR反響后,產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶位置。用限制性內切酶PmeⅠ分別對PON1擴增產物及pWPI-GFP慢病毒載體進行酶切(37℃水浴4h),并將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離,采用凝膠純化回收試劑盒純化酶切產物,進而在T4連接酶作用下于16℃連接過夜。次日,連接液轉化感受態(tài)細菌DH5,鋪于含氨芐青霉素(ampicillin,Amp)的LB培養(yǎng)平板上過夜培養(yǎng),第2天可挑取單菌落接種于小量含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,振搖過夜,收集菌體進行質粒小量提取及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子;純化重組質粒送上海桑尼生物科技有限公司進行DNA測序,確證插入目的序列的正確方向,無堿基突變。1.2.2pWPI-PON1重組載體轉染293T細胞將對數生長期的293T細胞接種于直徑10cm的細胞培養(yǎng)皿,給予10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),待密度至40%-50%且細胞生長狀態(tài)良好時進行轉染,轉染前2h細胞換液(全培養(yǎng)基)。在兩個無菌圓底試管中分別用500l溶液準備預混的磷酸鈣轉染體系:管1含20gDNA、62l2mol/LCaCl2;管2為2HEPES緩沖液(pH7.1),將管1溶液逐滴參加管2并渦旋震蕩,室溫孵育20min后,逐滴參加293T細胞培養(yǎng)板并混勻,12h后更換新的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,分別于0,12,24,36,48及60h時間點用倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光表示出情況,并收取0.2ml培養(yǎng)基,用于測培養(yǎng)基中PON1含量和活性。1.2.3Westernblotting檢測培養(yǎng)基中PON1的含量不同時間點收集的培養(yǎng)基加5凝膠上樣緩沖液處理,取35l進行10%SDS分離,將凝膠中蛋白電轉移至硝酸纖維素膜,再依次進行PON1一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及ECL化學發(fā)光法顯影,以凝膠成像系統(tǒng)掃描分析,檢測樣品中目的蛋白的相對含量。1.2.4PON1活性測定將轉染后不同時間點收取的細胞培養(yǎng)液,按本室建立的方式方法測定PON1活性,即:采用酶水解底物對氧磷為對硝基酚的原理,以100mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.5)建立200l的分析體系:含50l樣品、1.2mmol/L對氧磷、2mmol/LCaCl2、2mol/LNaCl,于25℃下,利用酶標儀(Eon,Biotek公司)在405nm處連續(xù)掃描記錄4min內產物生成速率。以每升血清(培養(yǎng)基)每分鐘生成產物對硝基酚的微摩爾數[mol/(minL)]表示1個PON1酶活性單位值(用kU/L表示單位)。1.2.5小鼠腹腔原代巨噬細胞的培養(yǎng)與氧化模型小鼠腹腔巨噬細胞取材于C57BL/6小鼠(購于武漢大學A3動物中心),實驗前于小鼠腹腔內注射3%巰基乙酸鹽肉湯3ml,第4天將小鼠安泰死,收集腹腔PBS灌洗液,調整細胞數以1106/孔鋪于6孔細胞板,以10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行原代細胞培養(yǎng),24h后換為1ml新鮮無血清高糖DMEM培養(yǎng)基,同時參加2ml慢病毒載體瞬時轉染293T細胞48h的培養(yǎng)基,氧化組以10mg/L氧化型LDL(oxidativeLDL,ox-LDL)[10mol/LCu2+與LDL1g/L,37℃共孵育24h,0.2mmol/LETDA(pH7.4)終止反響,透析,0.45m過濾獲得]處理細胞建立氧化條件,細胞置于37℃、5%CO2溫箱繼續(xù)孵育,收集6h時各孔的條件培養(yǎng)液及RIPA裂解液處理的細胞,留做炎癥因子的檢測分析。1.2.6ELISA法檢測TNF-、IL-6的水平培養(yǎng)基中TNF-、IL-6水平的檢測采用ELISA法按試劑盒講明進行,于酶標儀450nm處測量,每個樣本重復3次。每孔細胞以Lowry法測定RIPA裂解液蛋白含量,細胞分泌入培養(yǎng)基中TNF-、IL-6的含量以單位細胞蛋白量的TNF-、IL-6水平(ng/g細胞蛋白)表示。1.2.7統(tǒng)計學分析實驗結果以x珔s表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,兩組間均數比擬采用t檢驗,P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1pWPI-PON1重組慢病毒載體構建與鑒定利用引物設計、PCR法獲得兩端添加酶切位點的PON1基因,PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中可見約1kb處有亮堂的DNA條帶,與預期PON1條帶基本一致(圖1A)。將純化的PCR擴增產物與pWPI載體經酶切連接、轉化后,挑選單菌落進行液體培養(yǎng)、提取質粒,經瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定大小后送檢測序,測序結果證實第1、2號為構建成功的pWPI-PON1重組載體(圖1B)。2.2pWPI-PON1重組體瞬時高效轉染以pWPI-GFP空載體為對照,利用磷酸鈣轉染法將pWPI-PON1重組體轉入293T細胞,轉染換液后于0,12,24,36,48,60h不同時間點在熒光顯微鏡下觀察轉染效率,可見慢病毒的高效轉染率(細胞GFP熒光陽性率可到達80%-90%),且隨時間延長,GFP蛋白表示出量持續(xù)增高(圖2)。2.3轉染后培養(yǎng)基中PON1的含量與活性轉染后不同時間點收取細胞培養(yǎng)基,Westernblotting檢測結果顯示,與pWPI-GFP轉染對照組比擬,pWPI-PON1轉染組可高表示出PON1并分泌入培養(yǎng)基中,PON1含量在60h內呈時間依賴性遞增趨勢(圖3)。同時采用對氧磷為底物檢測PON1活性,pWPI-GFP轉染組的細胞培養(yǎng)基中幾乎無PON1活性,而pWPI-PON1轉染組培養(yǎng)基中PON1活性隨時間遞增而升高,且在48h可達最高(圖4)。2.4培養(yǎng)基中PON1對巨噬細胞分泌TNF-、IL-6的影響采用ELISA法檢測PON1孵育對巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-、IL-6的影響,結果顯示(圖5),與基礎對照組相比,含PON1(活性為8.3kU/L)的培養(yǎng)基與巨噬細胞共孵育6h時,細胞分泌TNF-、IL-6的水平明顯降低P0.01);在ox-LDL作用下,細胞分泌TNF-、IL-6的水平顯著上升,而參加含PON1的培養(yǎng)基共孵育,可使細胞TNF-、IL-6炎癥因子水平降低,差異有顯著性(P0.01)。3討論HDL是公認的體內抗動脈粥樣硬化的保衛(wèi)因子,PON1作為HDL特異結合的抗氧化酶成分,已發(fā)現(xiàn)其酯酶活性能作用多種底物,如水解LDL的氧化磷脂和血小板活化因子等,可抑制LDL的氧化修飾,純化的PON1可獨立抑制TNF-誘導的細胞黏附因子1的表示出,此作用可以以與HDL結合而加強,故PON1的存在及其抗氧化抗炎活性對于HDL的完好性與功能不可缺少,其在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。前期有研究利用PON1轉基因鼠來源的巨噬細胞,證實細胞內高表示出PON1可發(fā)揮其抗氧化抗炎而對動脈粥樣硬化有明顯防御作用。但小鼠腹腔巨噬細胞或骨髓來源的巨噬細胞幾乎不表示出PON1。PON1主要從肝臟合成后分泌入血,因而,為更好說明循環(huán)中PON1對巨噬細胞的影響,我們選擇了慢病毒表示出系統(tǒng),此類重組逆轉錄病毒經不斷完善,可使外源基因長效、穩(wěn)定表示出外源蛋白,有利于代謝性疾病等慢性病研究中的長效動物實驗,已成為基因功能研究和臨床治療最有應用前景的生物工具。本實驗中利用重組慢病毒載體轉染真核293T細胞,獲得了持續(xù)高活性PON1的表示出分泌,進一步與小鼠腹腔原代巨噬細胞共孵育,模擬了細胞外環(huán)境中PON1的作用方式,進而觀察到外源PON1顯著降低細胞炎癥,使其產生TNF-、IL-6的水平明顯減少。有研究報道,PON1的抗炎作用可通過促使巨噬細胞清道夫受體BI(SRBI)的高表示出,抑制TLR-4活化,下調NF-B介導的炎癥活化通路;可以能發(fā)揮抗凋亡而保衛(wèi)巨噬細胞。另有實驗證明,PON1可通過直接減少炎癥刺激引起的ROS水平,加強HDL抗炎活性。本實驗中采用熒光顯微鏡觀察到磷酸鈣轉染法可獲得外源蛋白的持續(xù)增加,培養(yǎng)基中PON1的活性也隨著升高,講明慢病毒載體對細胞的毒性影響并不顯著。對于60h