對(duì)氧磷酯酶亞型1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制,病理學(xué)論文

對(duì)氧磷酯酶亞型1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制,病理學(xué)論文對(duì)氧磷酯酶(Paraoxonase,PON)是一類鈣依靠性的催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶,因其常見底物為對(duì)氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三種亞型,華而不實(shí)PON1主要由肝臟合成分泌入血、高親和結(jié)合于高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL),是HDL發(fā)揮抗氧化及抗炎的主要成分。大量流行病學(xué)調(diào)查表示清楚,人群中可因PON1基因多態(tài)性、衰老、冠心病、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病因素出現(xiàn)血清PON1活性降低,我們前期的調(diào)研也以為,血清低PON1活性可作為評(píng)估冠心病事件發(fā)生及嚴(yán)重程度的一種危險(xiǎn)標(biāo)志。一系列實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí),PON1具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用:PON1基因敲除(PON1geneknockout,PON1-/-)小鼠可觀察到體內(nèi)HDL更容易氧化,低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)氧化明顯增加,高脂條件下更易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊構(gòu)成;在apoE基因敲除小鼠中高表示出PON1,HDL抗氧化能力加強(qiáng),可有效減緩粥樣斑塊的發(fā)展;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),PON1轉(zhuǎn)基因或高表示出可降低巨噬細(xì)胞過氧化物水平,顯著抑制炎癥因子腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-,TNF-)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的合成和分泌,明顯改善巨噬細(xì)胞的炎癥氧化狀態(tài)。盡管PON1確切的作用底物及相關(guān)機(jī)制仍未徹底說明,但其抗炎抗氧化活性顯然對(duì)于抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)有重要意義。因而,本研究擬構(gòu)建含人源性PON1基因的慢病毒載體,旨在真核細(xì)胞高效表示出分泌PON1,為進(jìn)一步研究PON1的生理性底物、相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生機(jī)制及臨床診治奠定基礎(chǔ)。1材料與方式方法1.1主要材料與試劑人胚腎上皮293T細(xì)胞購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心;pWPI-GFP慢病毒表示出載體受贈(zèng)于美國(guó)SouthCarolina大學(xué)醫(yī)學(xué)院樊大平博士;來源于人肝cDNA文庫含PON1的pUC載體購于Genecopoeia公司;質(zhì)粒提取試劑盒購于TIANGEN公司;LB培養(yǎng)基為OXOID公司產(chǎn)品;PCR相關(guān)試劑為Takara公司產(chǎn)品;DNA凝膠純化回收試劑盒購于Axygen公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清購自Gibco公司;對(duì)氧磷(paraox-on)、巰基乙酸鹽肉湯(thioglycollatebroth)為Sigma公司試劑;LDL購于ProSpec-Tany公司;蛋白Marker、核酸Marker、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所;PON1抗體、羊抗小鼠IgG為Abcam公司產(chǎn)品;ECL化學(xué)顯影液購于Thermo公司;TNF-、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于eBioscience公司;其它試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。1.2方式方法1.2.1pWPI-PON1重組載體的構(gòu)建根據(jù)慢病毒載體圖譜及購買的pUC19質(zhì)粒中PON1序列,設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變PCR的特異寡核苷酸引物,即于目的基因的5端添加上PmeⅠ酶切位點(diǎn),上游引物5-TACGTTTAAACTCCCCGACCATGGCGAAG-3,下游引物5-GGCGGCGTTTAAACTTAGAGCT-CACAGTAA-3(下劃線標(biāo)記處為PmeⅠ酶切位點(diǎn)),引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為1068bp。PCR條件(95℃變性,55℃退火,72℃延伸)PCR反響后,產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶位置。用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ分別對(duì)PON1擴(kuò)增產(chǎn)物及pWPI-GFP慢病毒載體進(jìn)行酶切(37℃水浴4h),并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離,采用凝膠純化回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物,進(jìn)而在T4連接酶作用下于16℃連接過夜。次日,連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5,鋪于含氨芐青霉素(ampicillin,Amp)的LB培養(yǎng)平板上過夜培養(yǎng),第2天可挑取單菌落接種于小量含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,振搖過夜,收集菌體進(jìn)行質(zhì)粒小量提取及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子;純化重組質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序,確證插入目的序列的正確方向,無堿基突變。1.2.2pWPI-PON1重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,給予10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待密度至40%-50%且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前2h細(xì)胞換液(全培養(yǎng)基)。在兩個(gè)無菌圓底試管中分別用500l溶液準(zhǔn)備預(yù)混的磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系:管1含20gDNA、62l2mol/LCaCl2;管2為2HEPES緩沖液(pH7.1),將管1溶液逐滴參加管2并渦旋震蕩,室溫孵育20min后,逐滴參加293T細(xì)胞培養(yǎng)板并混勻,12h后更換新的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,分別于0,12,24,36,48及60h時(shí)間點(diǎn)用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光表示出情況,并收取0.2ml培養(yǎng)基,用于測(cè)培養(yǎng)基中PON1含量和活性。1.2.3Westernblotting檢測(cè)培養(yǎng)基中PON1的含量不同時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)基加5凝膠上樣緩沖液處理,取35l進(jìn)行10%SDS分離,將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,再依次進(jìn)行PON1一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,以凝膠成像系統(tǒng)掃描分析,檢測(cè)樣品中目的蛋白的相對(duì)含量。1.2.4PON1活性測(cè)定將轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收取的細(xì)胞培養(yǎng)液,按本室建立的方式方法測(cè)定PON1活性,即:采用酶水解底物對(duì)氧磷為對(duì)硝基酚的原理,以100mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.5)建立200l的分析體系:含50l樣品、1.2mmol/L對(duì)氧磷、2mmol/LCaCl2、2mol/LNaCl,于25℃下,利用酶標(biāo)儀(Eon,Biotek公司)在405nm處連續(xù)掃描記錄4min內(nèi)產(chǎn)物生成速率。以每升血清(培養(yǎng)基)每分鐘生成產(chǎn)物對(duì)硝基酚的微摩爾數(shù)[mol/(minL)]表示1個(gè)PON1酶活性單位值(用kU/L表示單位)。1.2.5小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)與氧化模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞取材于C57BL/6小鼠(購于武漢大學(xué)A3動(dòng)物中心),實(shí)驗(yàn)前于小鼠腹腔內(nèi)注射3%巰基乙酸鹽肉湯3ml,第4天將小鼠安泰死,收集腹腔PBS灌洗液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)以1106/孔鋪于6孔細(xì)胞板,以10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),24h后換為1ml新鮮無血清高糖DMEM培養(yǎng)基,同時(shí)參加2ml慢病毒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h的培養(yǎng)基,氧化組以10mg/L氧化型LDL(oxidativeLDL,ox-LDL)[10mol/LCu2+與LDL1g/L,37℃共孵育24h,0.2mmol/LETDA(pH7.4)終止反響,透析,0.45m過濾獲得]處理細(xì)胞建立氧化條件,細(xì)胞置于37℃、5%CO2溫箱繼續(xù)孵育,收集6h時(shí)各孔的條件培養(yǎng)液及RIPA裂解液處理的細(xì)胞,留做炎癥因子的檢測(cè)分析。1.2.6ELISA法檢測(cè)TNF-、IL-6的水平培養(yǎng)基中TNF-、IL-6水平的檢測(cè)采用ELISA法按試劑盒講明進(jìn)行,于酶標(biāo)儀450nm處測(cè)量,每個(gè)樣本重復(fù)3次。每孔細(xì)胞以Lowry法測(cè)定RIPA裂解液蛋白含量,細(xì)胞分泌入培養(yǎng)基中TNF-、IL-6的含量以單位細(xì)胞蛋白量的TNF-、IL-6水平(ng/g細(xì)胞蛋白)表示。1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x珔s表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間均數(shù)比擬采用t檢驗(yàn),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1pWPI-PON1重組慢病毒載體構(gòu)建與鑒定利用引物設(shè)計(jì)、PCR法獲得兩端添加酶切位點(diǎn)的PON1基因,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中可見約1kb處有亮堂的DNA條帶,與預(yù)期PON1條帶基本一致(圖1A)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pWPI載體經(jīng)酶切連接、轉(zhuǎn)化后,挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)、提取質(zhì)粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定大小后送檢測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證實(shí)第1、2號(hào)為構(gòu)建成功的pWPI-PON1重組載體(圖1B)。2.2pWPI-PON1重組體瞬時(shí)高效轉(zhuǎn)染以pWPI-GFP空載體為對(duì)照,利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將pWPI-PON1重組體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染換液后于0,12,24,36,48,60h不同時(shí)間點(diǎn)在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,可見慢病毒的高效轉(zhuǎn)染率(細(xì)胞GFP熒光陽性率可到達(dá)80%-90%),且隨時(shí)間延長(zhǎng),GFP蛋白表示出量持續(xù)增高(圖2)。2.3轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中PON1的含量與活性轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞培養(yǎng)基,Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與pWPI-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組比擬,pWPI-PON1轉(zhuǎn)染組可高表示出PON1并分泌入培養(yǎng)基中,PON1含量在60h內(nèi)呈時(shí)間依賴性遞增趨勢(shì)(圖3)。同時(shí)采用對(duì)氧磷為底物檢測(cè)PON1活性,pWPI-GFP轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞培養(yǎng)基中幾乎無PON1活性,而pWPI-PON1轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中PON1活性隨時(shí)間遞增而升高,且在48h可達(dá)最高(圖4)。2.4培養(yǎng)基中PON1對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-、IL-6的影響采用ELISA法檢測(cè)PON1孵育對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-、IL-6的影響,結(jié)果顯示(圖5),與基礎(chǔ)對(duì)照組相比,含PON1(活性為8.3kU/L)的培養(yǎng)基與巨噬細(xì)胞共孵育6h時(shí),細(xì)胞分泌TNF-、IL-6的水平明顯降低P0.01);在ox-LDL作用下,細(xì)胞分泌TNF-、IL-6的水平顯著上升,而參加含PON1的培養(yǎng)基共孵育,可使細(xì)胞TNF-、IL-6炎癥因子水平降低,差異有顯著性(P0.01)。3討論HDL是公認(rèn)的體內(nèi)抗動(dòng)脈粥樣硬化的保衛(wèi)因子,PON1作為HDL特異結(jié)合的抗氧化酶成分,已發(fā)現(xiàn)其酯酶活性能作用多種底物,如水解LDL的氧化磷脂和血小板活化因子等,可抑制LDL的氧化修飾,純化的PON1可獨(dú)立抑制TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附因子1的表示出,此作用可以以與HDL結(jié)合而加強(qiáng),故PON1的存在及其抗氧化抗炎活性對(duì)于HDL的完好性與功能不可缺少,其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。前期有研究利用PON1轉(zhuǎn)基因鼠來源的巨噬細(xì)胞,證實(shí)細(xì)胞內(nèi)高表示出PON1可發(fā)揮其抗氧化抗炎而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有明顯防御作用。但小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或骨髓來源的巨噬細(xì)胞幾乎不表示出PON1。PON1主要從肝臟合成后分泌入血,因而,為更好說明循環(huán)中PON1對(duì)巨噬細(xì)胞的影響,我們選擇了慢病毒表示出系統(tǒng),此類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)不斷完善,可使外源基因長(zhǎng)效、穩(wěn)定表示出外源蛋白,有利于代謝性疾病等慢性病研究中的長(zhǎng)效動(dòng)物實(shí)驗(yàn),已成為基因功能研究和臨床治療最有應(yīng)用前景的生物工具。本實(shí)驗(yàn)中利用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染真核293T細(xì)胞,獲得了持續(xù)高活性PON1的表示出分泌,進(jìn)一步與小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞共孵育,模擬了細(xì)胞外環(huán)境中PON1的作用方式,進(jìn)而觀察到外源PON1顯著降低細(xì)胞炎癥,使其產(chǎn)生TNF-、IL-6的水平明顯減少。有研究報(bào)道,PON1的抗炎作用可通過促使巨噬細(xì)胞清道夫受體BI(SRBI)的高表示出,抑制TLR-4活化,下調(diào)NF-B介導(dǎo)的炎癥活化通路;可以能發(fā)揮抗凋亡而保衛(wèi)巨噬細(xì)胞。另有實(shí)驗(yàn)證明,PON1可通過直接減少炎癥刺激引起的ROS水平,加強(qiáng)HDL抗炎活性。本實(shí)驗(yàn)中采用熒光顯微鏡觀察到磷酸鈣轉(zhuǎn)染法可獲得外源蛋白的持續(xù)增加,培養(yǎng)基中PON1的活性也隨著升高,講明慢病毒載體對(duì)細(xì)胞的毒性影響并不顯著。對(duì)于60h