基因工程重組體轉入受體細胞

基因工程重組體轉入受體細胞第五章重組體導入受體細胞第一節(jié)重組體導入細菌細胞第二節(jié)重組DNA導入真核細胞2021/4/272第一節(jié)重組體導入細菌細胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DNA導入大腸桿菌2021/4/2731.目的增加受體菌細胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第一節(jié)重組體導入細菌細胞2021/4/274使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種2021/4/2752021/4/276用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理2021/4/2774.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸2021/4/278二、重組DNA導入大腸桿菌（1）轉化（transformation)（3）轉染（transfection)1.外源DNA導入細菌的幾種方法（2）轉導（transduction)2021/4/279轉化：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。轉化(transformation)2021/4/2710轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用轉導(transduction)2021/4/2711轉染(transfection)轉染是轉化的一種特殊形式。由transformation（轉化）和infection（感染）兩詞構成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構建的重組子導入受體細胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉染。將任何類型DNA轉移至動物細胞內的過程均可叫轉染。2021/4/2712例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。轉化（transformation)2021/4/2713λ噬菌體的生活史例轉導（transduction)2021/4/2714每gDNA轉化成功的細菌克隆數。3.轉化方法2.轉化率簡單，但轉化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉化法2021/4/271510ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法2021/4/2716LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉儀調為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉化液涂含抗菌素的平板轉化（2）電轉化法2021/4/27174.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100L轉化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜2021/4/2718環(huán)形重組質粒質粒自我連接線性載體或DNA片斷進入細菌會被降解。①環(huán)形質粒數（1）重組質粒5.影響轉化率的因素2021/4/2719目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連2021/4/2720①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細菌細胞膜增加通透性。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細胞（competentcells)2021/4/2721把重組的噬菌體DNA或Cosmid質粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉導（1）體外包裝（invitropackaging）2021/4/2722cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后，在32℃下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。但當溫度升高到44℃—45℃時，就會導致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復制、外殼蛋白合成。（2）cI857基因突變的噬菌體2021/4/2723噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（3）互補型噬菌體外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體22021/4/2724E基因突變只合成尾部蛋白和包裝識別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的載體DNA體外包裝成活性噬菌體2021/4/2725(4)體外包裝過程2021/4/2726體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（5）轉導2021/4/27272021/4/2728第二節(jié)外源基因導入真核細胞一、導入酵母細胞二、導入植物細胞三、導入哺乳動物細胞2021/4/2729轉化率高的菌株；有突變的菌株（與導入的載體基因互補）；不育的菌株（不會與其他酵母接合）。第二節(jié)外源基因導入真核細胞一、導入酵母細胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his312021/4/2730（1）利用原生質球進行轉化2.酵母的轉化方法

酵母原生質體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細胞壁具有通透性，允許DNA進入。CaCl2使細胞膜具有通透性，允許DNA進入。轉化2021/4/2731

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG（聚乙二醇）（2）利用Li+鹽進行轉化2021/4/2732葉盤消毒切取土壤農桿菌浸泡看護培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導入植物細胞1.葉盤法（leafdisk)2021/4/2733植物細胞原生質體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)2021/4/2734又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）2021/4/2735基因槍2021/4/2736（1）原理：三、導入哺乳動物細胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據不同的細胞類型，平皿上最多能有10%的細胞能吸收DNA沉淀。2021/4/2737不需要載體。