抗原與抗體的相互作用及免疫學(xué)檢測(cè)

抗原與抗體的相互作用及免疫學(xué)檢測(cè)體液免疫的基礎(chǔ)是抗原和抗體分子的結(jié)合，這種結(jié)合可以是游離形式的，也可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)抗原抗體的結(jié)合繼發(fā)出各種生理效應(yīng)，如：溶細(xì)胞效應(yīng)、促吞噬作用、凝集作用、沉淀作用、調(diào)節(jié)作用等，形成一整套機(jī)體體液免疫功能?？乖瓫Q定簇與抗體結(jié)合部位的結(jié)合，要求分子結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性，也因此具有高度的特異性。2021/4/272第一節(jié)抗原與抗體反應(yīng)的特點(diǎn)一、特異性抗原與抗體相互結(jié)合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點(diǎn)之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起。抗原抗體的結(jié)合并沒(méi)有共價(jià)鍵形成，而是由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專(zhuān)一性。2021/4/273抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種：1、鹽鍵（離子鍵）2、范德華力3、疏水作用4、氫鍵2021/4/274二、抗原與抗體結(jié)合的可逆性抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)可逆的反應(yīng)Ab+AgAb:Ag由于抗原抗體結(jié)合的可逆性，可利用親和層析法分離純化抗原或抗體；利用待測(cè)抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原與抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，進(jìn)行抗原或抗體的定量測(cè)定，如放免檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法等2021/4/275三、抗原與抗體反應(yīng)中量的關(guān)系當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時(shí)，如果是顆?？乖?，則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用。這些可見(jiàn)現(xiàn)象的出現(xiàn)是以抗原與抗體反應(yīng)特異性和親和力為基礎(chǔ)的，同時(shí)也是抗原抗體反應(yīng)的繼發(fā)過(guò)程。當(dāng)抗原與同型抗體相遇時(shí)，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這一過(guò)程通常只需要幾秒的時(shí)間便可完成，稱(chēng)為反應(yīng)的一級(jí)階段。2021/4/276在一級(jí)階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進(jìn)一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝集物，進(jìn)而出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集和沉淀，稱(chēng)為反應(yīng)的二級(jí)階段。這一階段是抗原抗體網(wǎng)格生長(zhǎng)的階段，速率要慢的多，且在很大程度上依賴(lài)于溫度、離子強(qiáng)度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比例。只有當(dāng)二者的結(jié)合價(jià)彼此飽和時(shí)，才能連接成一個(gè)大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。2021/4/2772021/4/278抗原抗體凝集（沉淀）反應(yīng)形成的特點(diǎn)：1、抗原結(jié)合價(jià)必須在2價(jià)以上；2、抗體結(jié)合價(jià)也必須是2價(jià)或2價(jià)以上；3、抗原抗體能形成復(fù)合物但不一定能形成沉淀；4、抗原抗體結(jié)合形成大分子凝集物的前提是要求其結(jié)合價(jià)彼此飽和；5、當(dāng)抗原大大過(guò)量時(shí)，只有溶解狀態(tài)的抗原抗體復(fù)合物，而無(wú)沉淀出現(xiàn)，在免疫檢測(cè)中稱(chēng)為前帶現(xiàn)象。2021/4/279第二節(jié)抗血清的制備和抗體的純化抗體產(chǎn)生的特異免疫應(yīng)答是指機(jī)體受外源物質(zhì)刺激后，產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的過(guò)程。在這一免疫應(yīng)答過(guò)程中，除依賴(lài)于抗原物質(zhì)有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)外，還依賴(lài)于動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。機(jī)體免疫應(yīng)答能力又受遺傳因素的控制及機(jī)體的生理狀況、抗原物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的途徑和佐劑的使用等因素的影響。由于動(dòng)物的遺傳性不同，同一抗原對(duì)不同種動(dòng)物、同種不同品系甚至不同個(gè)體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此，在進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)，必須選擇對(duì)該抗原敏感的動(dòng)物，而且必須是年輕的、健康的。常用的動(dòng)物有馬、羊、兔、鼠和豚鼠。2021/4/2710當(dāng)抗原初次進(jìn)入具有應(yīng)答能力的動(dòng)物體內(nèi)后，經(jīng)過(guò)一段較長(zhǎng)的潛伏期才出現(xiàn)抗體，又經(jīng)過(guò)一段高峰期后，抗體量逐漸下降直至消失。這段時(shí)間總的抗體量是較低的，主要成分是IgM，此為機(jī)體對(duì)抗原的初次反應(yīng)。但當(dāng)抗原再次進(jìn)入該機(jī)體時(shí)，血清中抗體很快出現(xiàn)，含量也遠(yuǎn)高于初次反應(yīng)，其抗體成分主要是IgG，此為再次反應(yīng)。2021/4/2711佐劑在抗血清制備中的作用：由于佐劑有吸附和包埋抗原的“儲(chǔ)藏所”作用，延長(zhǎng)了抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，便于抗原較長(zhǎng)時(shí)間的、不間斷的刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使初次反應(yīng)與再次反應(yīng)結(jié)合在一起，其免疫效果更為理想。另外，在佐劑中含有激活巨噬細(xì)胞等生理功能的卡介苗類(lèi)物質(zhì)，可提高抗原的免疫原性，因此要獲得高效價(jià)的抗血清，常使用各種類(lèi)型的佐劑。2021/4/2712動(dòng)物個(gè)體的不同組織部位對(duì)抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴結(jié)、脾臟、足掌、眼瞼結(jié)膜等是反應(yīng)敏感部位，也是免疫動(dòng)物的常用部位。2021/4/2713一、動(dòng)物的免疫1、抗原用量：0.5mg/kg2、佐劑：弗氏佐劑弗氏佐劑的成分和使用3、免疫方法：淋巴結(jié)注射、腹部皮下注射、四足掌皮內(nèi)注射。4、免疫次數(shù)：每隔7-10天免疫一次，共需3-4次。第二次免疫后開(kāi)始測(cè)效價(jià)。2021/4/2714二、抗血清制備和抗體效價(jià)測(cè)定1、采血方法：兔頸動(dòng)脈放血、兔心臟取血、兔耳緣靜脈放血、鼠心臟取血、剪尾采血、眼窩采血。2、抗血清制備：血液室溫放置1-2h或冰箱內(nèi)4度過(guò)夜，血清便可充分析出，用滴管吸出或離心分離取得。分離好的血清加入0.02%疊氮化鈉，在4度冰箱內(nèi)保存可長(zhǎng)達(dá)半年。3、效價(jià)測(cè)定：用免疫動(dòng)物時(shí)的抗原濃度作抗體效價(jià)測(cè)定的抗原濃度。以出現(xiàn)沉淀反應(yīng)的抗血清的最大稀釋倍數(shù)來(lái)表示抗血清的效價(jià)。2021/4/2715三、免疫球蛋白的純化由于抗原抗體的結(jié)合具有高度的特異性，在免疫檢測(cè)中常常直接運(yùn)用抗血清進(jìn)行，而無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行純化。隨著免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，如用鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記抗體作免疫電鏡觀測(cè)，用熒光素、酶、同位素標(biāo)記抗體作組織細(xì)胞染色，或?qū)乖M(jìn)行定量測(cè)定，就必須對(duì)抗體進(jìn)行純化，但這類(lèi)的純化多數(shù)是類(lèi)別的純化。2021/4/2716抗體純化的方法：1、硫銨鹽析法：簡(jiǎn)便、蛋白質(zhì)變性較少，33%飽和度的硫銨可以沉淀所有各類(lèi)免疫球蛋白；缺點(diǎn)是分離的純度較差，對(duì)IgA類(lèi)抗體來(lái)說(shuō)，濃鹽可使其形成二聚體，不宜采用。2021/4/27172、Cohn冷酒精沉淀法：2021/4/2718IgA相對(duì)分子量160000，IgM相對(duì)分子量1000000，故可通過(guò)分子篩將兩者分開(kāi)而得到純品。2021/4/27193、硫銨鹽析和DEAE-纖維素柱層析法純化IgG在pH7.5的溶液中IgG帶正電，其他血清蛋白帶負(fù)電，因此陰離子交換劑DEAE-纖維素可以一次將IgG提純到很高的純度2021/4/27204、IgM的純化方法：18%飽和度硫銨沉淀+DEAE-纖維素柱層析法。2021/4/2721第三節(jié)抗原與抗體反應(yīng)-免疫檢測(cè)法抗原與抗體結(jié)合后，只有出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)，如凝集、溶血、沉淀實(shí)驗(yàn)等，或用熒光素、酶、放射性同位素等標(biāo)記方法提高可測(cè)性，才便于在免疫檢測(cè)中運(yùn)用?？梢?jiàn)性反應(yīng)的出現(xiàn)，對(duì)抗原抗體分子合適比例的要求遠(yuǎn)比對(duì)彼此絕對(duì)量方面要高得多。這就是說(shuō)，一方面在進(jìn)行免疫檢測(cè)時(shí)要注意抗原抗體的用量；另一方面只要提高可見(jiàn)度或可測(cè)性，便可大大提高免疫檢測(cè)方法的靈敏度。2021/4/2722一、凝集反應(yīng)

凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見(jiàn)性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱(chēng)為凝集原，抗體稱(chēng)為凝集素。2021/4/2723二、沉淀反應(yīng)

當(dāng)抗原是可溶性分子時(shí)，與抗體結(jié)合則形成沉淀。1、絮狀沉淀反應(yīng)一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見(jiàn)到絮狀的蛋白質(zhì)沉淀。可用于尋找抗原抗體反應(yīng)的合適比例，檢測(cè)抗原抗體的分子比。2、環(huán)狀沉淀反應(yīng)在試管中加入抗體后，小心加入相應(yīng)抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測(cè)定。2021/4/27243、雙向擴(kuò)散：又稱(chēng)瓊脂擴(kuò)散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過(guò)，分子的擴(kuò)散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時(shí)形成沉淀?？捎^測(cè)到沉淀弧。沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多條沉淀弧。2021/4/2725雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測(cè)定抗體效價(jià)，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測(cè)抗原的存在和定性抗原。2021/4/2726抗原抗體為單一體系時(shí)，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時(shí)，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。2021/4/27274、單向免疫擴(kuò)散：又稱(chēng)單向瓊脂擴(kuò)散，是定量抗原的一種檢測(cè)方法。與雙向擴(kuò)散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應(yīng)抗原。在37度保溫過(guò)程中，孔內(nèi)的抗原向周?chē)鷶U(kuò)散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小確定抗原的含量2021/4/2728

另外還有其他眾多的免疫檢測(cè)技術(shù)和手段，其機(jī)理都利用了抗原抗體的沉淀反應(yīng)。例如微量免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳等。只不過(guò)其檢測(cè)的對(duì)象和檢測(cè)的目的各有不同。2021/4/2729三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)當(dāng)抗體與細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖Y(jié)合并形成抗原抗體復(fù)合物后，可結(jié)合補(bǔ)體引起溶菌、溶血效應(yīng)。用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)既可以測(cè)知患者血清中補(bǔ)體的總量，也可以檢測(cè)未知抗原或抗體的量。測(cè)定人血清補(bǔ)體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當(dāng)綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測(cè)溶血程度。2021/4/2730用于測(cè)定未知抗原/抗體時(shí)，采用兩套系統(tǒng)，一套是待測(cè)的抗原抗體系統(tǒng)，稱(chēng)為檢測(cè)系統(tǒng)，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統(tǒng)。待測(cè)系統(tǒng)中有無(wú)待測(cè)得抗原/抗體是利用指示系統(tǒng)中是否出現(xiàn)溶血來(lái)判斷。反應(yīng)的過(guò)程是首先加待測(cè)得抗原/抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后加入補(bǔ)體，在反應(yīng)一段時(shí)間后加指示系統(tǒng)。有待測(cè)抗原抗體結(jié)合時(shí)，必然結(jié)合補(bǔ)體，不會(huì)出現(xiàn)溶血，沒(méi)有待測(cè)物質(zhì)時(shí)出現(xiàn)溶血。2021/4/27312021/4/2732四、熒光抗體技術(shù)免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學(xué)方式結(jié)合起來(lái)，然后將此熒光標(biāo)記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標(biāo)本，使與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進(jìn)行觀察。當(dāng)出現(xiàn)熒光時(shí)，表明標(biāo)記抗體存在，相應(yīng)的抗原也存在。免疫熒光法有直接法和間接法兩種。2021/4/27332021/4/2734第四節(jié)免疫親和層析生物高分子具有能和某種相對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專(zhuān)一的底物、抑制劑、輔助因子效應(yīng)劑通過(guò)某些次級(jí)鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離?？贵w與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補(bǔ)的脫氧核糖核酸等體系，都具有類(lèi)似的特性。這種高分子和配基之間形成專(zhuān)一的可解離的復(fù)合物的能力稱(chēng)為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來(lái)的層析就稱(chēng)為親和層析。2021/4/2735親和層析法的基本過(guò)程：1、偶聯(lián)：