專題2-課題2-土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)

課題背景尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能干脆被農(nóng)作物吸取。土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+2NH3CO2+H2O問：1尿素如何被利用的呢？2細菌為什么能分解尿素？土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分別出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中原委含有多少這樣的細菌學習目標分解1.知道篩選目的菌株的思路和計數(shù)的方法，原理2.駕馭從土壤中分別分解尿素的微生物及進行平板計數(shù)的方法.一.探討思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設置比照1、實例：DNA多聚酶鏈式反應(PCR技術)是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求運用耐高溫（930C左右）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株提出的問題—如何找尋耐高溫的酶？解決問題的思路—找尋耐高溫環(huán)境啟示：找尋目的菌種時要依據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去找尋。原理—高溫淘汰其他菌種，選出耐高溫菌種，耐高溫菌種提取耐高溫酶。閱讀P21-23，思索：1、說出試驗室中微生物的篩選原理2、依據(jù)本課題所運用的培育基，回答：①從物理性質(zhì)看此培育基屬于哪類？②該培育基的配方中，為微生物的生長供應碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？③此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？3、總結(jié)統(tǒng)計菌落數(shù)目常用的方法，并據(jù)此分析P22（二）中兩位同學的結(jié)果是否合理。4、分析P22（三）中A同學的試驗，想想如何對其結(jié)果進行驗證要分別一種微生物，必需依據(jù)該微生物的特點，包括養(yǎng)分、生理、生長條件等，配置合適的培育基。方法：⑴抑制大多數(shù)微生物生長⑵造成有利于該菌生長的環(huán)境結(jié)果：培育確定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過稀釋涂布平板法等方法對它進行純化培育分別。2、試驗室中微生物的篩選原理：人為供應有利于目的菌株生長的條件(包括養(yǎng)分、溫度、pH等)，同時抑制或阻擋其他微生物生長。選擇培育基15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、本課題所運用的培育基：①從物理性質(zhì)看此培育基屬于哪類？固體培育基②該培育基的配方中，為微生物的生長供應碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？③此培育基能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？碳源：葡萄糖氮源：尿素能。該培育基的唯一氮源為尿素，只有產(chǎn)生脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源而生存。試驗組比照組培育基類型是否接種

目的

結(jié)果以尿素為唯一氮源的培育基牛肉膏蛋白胨培育基

是是分別分解尿素的細菌推斷該培育基有無選擇性只生長分解尿素的細菌生長多種微生物怎樣證明此培育基具有選擇性呢？1、顯微鏡干脆計數(shù)：可以利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算確定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；個體小的細菌在顯微鏡下難以視察缺點2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）（1）常用方法：每克樣品中的菌株數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。當樣品的稀釋度足夠高時，培育基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推想出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法思索：活菌計數(shù)法統(tǒng)計的菌落數(shù)是否與活菌實際數(shù)目吻合？為什么？統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上視察到的只有一個菌落因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應稀釋倍數(shù)為106的培育基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這兩位同學的做法正確嗎？假如有問題，錯在哪？甲：沒有重復試驗（至少涂布3個平板）乙：A組結(jié)果誤差過大，不應用于計算平均值注：誤差太大，須重做或再多設幾組?留意事項①為了保證結(jié)果精確，一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值將同一稀釋度至少涂布三個平板作重復組，培育計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)來表示。⑤每克樣品中的菌株數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。利用選擇培育基進行尿素分解菌的分別過程中，從對應稀釋倍數(shù)為106的培育基中，A、B兩同學分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、A同學篩選出150個菌落。2、B同學篩選出50個菌落。B認為A的培育基被雜菌污染了，或培育基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培育基中生長。A確認自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。

?緣由：⑴土樣不同⑵培育基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))小結(jié)：通過這個事例可以看出，試驗結(jié)果要有勸服力，比照組的設置是必不行少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行試驗方案二：將A同學配制的培育基在不加土樣的狀況下進行培育，作為空白比照，以證明培育基是否受到污染。結(jié)果預料：a.假如結(jié)果與A同學一樣，則證明A無誤；b.假如結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培育基的配制有問題。設置比照的主要目的是解除試驗組中非測試因素對試驗結(jié)果的影響，提高試驗結(jié)果的可信度。㈢.設置比照：限制變量設置比照的方法：空白比照：不給比照組任何處理因素。條件比照：給比照組施以部分試驗因素，但不是所要探討的處理因素。自身比照：比照組和試驗組都在同一探討對象上進行。相互比照：不單設比照組，而是幾個試驗組相互比照。練習：推斷正誤：1、依據(jù)培育皿中菌落數(shù)可以精確計算樣品中含有的活菌實際數(shù)目（）2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（）3、篩選分解尿素的細菌應以尿素作為培育基中的唯一氮源（）4、統(tǒng)計樣品中的活菌一般用平板劃線法（）×√×√【鞏固1】分別土壤中分解尿素的細菌，對培育基的要求是()。①加尿素②不加尿素③加瓊脂④不加瓊脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸鹽⑧不加硝酸鹽A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦【鞏固2】用來推斷選擇培育基是否起到了選擇作用，須要設置的比照是()。 A.未接種的選擇培育基 B.未接種的牛肉膏蛋白胨培育基 C.接種了的牛肉膏蛋白胨培育基 D.接種了的選擇培育基CC閱讀P23-26，思索：1、說出土壤取樣的緣由和操作方法2、說出樣品稀釋的目的，熟記細菌、放線菌、真菌的稀釋倍數(shù)3、熟記細菌、放線菌、霉菌的培育溫度和時間4、說明鑒定該種細菌能夠分解尿素的方法二、試驗設計：土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋取樣涂布平板微生物培養(yǎng)、觀察菌落計數(shù)二.試驗設計㈠.土壤取樣同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多?！羧右螅合如P去表層土3cm左右，再取樣◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在運用前都要滅菌。P25㈡.制備培育基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培育基。（三）樣品的稀釋◆應在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。P25

◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行?！粼趯嶋H操作中，通常選用確定稀釋范圍的樣品液進行培育。以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板。細菌稀釋度為104、105、106放線菌稀釋度為103、104、105真菌稀釋度為102、103、104為什么分別不同的微生物要接受不同的稀釋度？緣由：土壤中各類微生物的數(shù)量是不同的。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就須要按不同的稀釋度進行分別，同時還應當有針對性地供應選擇培育的條件。測定土壤中細菌的數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培育，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋。其緣由是（）A.細菌個體小，真菌個體大B.細菌易稀釋，真菌不易稀釋C.細菌在土壤中的數(shù)量比真菌多D.隨機的，沒有緣由C◆試驗時要對培育皿作好標記。注明培育基類型、培育時間、稀釋度、培育物等。㈣.取樣涂布㈤.微生物的培育與視察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培育時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。不同種類的微生物，往往須要不同的培育溫度和培育時間：細菌：30～37℃培育1～2d放線菌：25～28℃培育5～7d霉菌：25～28℃培育3～4d一般來說，在確定的培育條件下（相同的培育基、溫度及培育時間），同種我微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。包括菌落的形態(tài)、大小、隆起程度和顏色等方面。菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。微生物的培育與視察〖思索〗在探討未知微生物時務必規(guī)范操作，以防被感染，試驗后確定要洗手。致病微生物三、操作提示P251、無菌操作2、做好標記3、制定支配◆為了提高效率，在操作時更加有條不紊，應當事先制定支配。四.結(jié)果分析與評價(一）培育物中是否有雜菌污染以及選擇培育基是否篩選出菌落通過比照試驗，若培育物有雜菌污染，比照的培育基菌落數(shù)偏高；若培牛肉膏蛋白胨培育基的菌落數(shù)遠大于選擇培育基的數(shù)目，說明選擇培育基已篩選出一些菌落。（二）樣品的稀釋操作是否成功及重復組的結(jié)果是否一樣提示：假如得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，假猶如一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，須要重新試驗。五.課外延長在以尿素為唯一氮源的培育基中加入酚紅指示劑。培育某種細菌后，假如PH上升，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法-濾膜法。是將確定體積的水過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培育基上培育，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過計數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

本課題學問小結(jié):1．下列是關于“檢測土壤中細菌總數(shù)”試驗操作的敘述，其中錯誤的是（）A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培育基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1mL，分別涂布于各組平板上C．將試驗組和比照組平板倒置，37℃恒溫培育24～48hD．確定比照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的試驗組平板進行計數(shù)實踐訓練D

2.推斷：利用稀釋涂布平板法既能分別微生物也能對微生物進行計數(shù)接種時連續(xù)劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋獲得單個菌落以尿素為唯一氮源且含酚紅的培育基可選擇和鑒別尿素分解菌√√√3．尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌（目的菌），培育基成分如表所示，試驗步驟如圖所示，請分析回答問題：（1）培育基中加入尿素的目的是篩選到________，這種培育基從功能上屬于____培育基。（2）“目的菌”生長所需的氮源來自培育基中的___________，其同化作用類型是______________。目的菌選擇異養(yǎng)型尿素15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到100mL（3）下圖是接受純化微生物培育的兩種接種方法接種后培育的效果圖。則獲得圖A效果的接種方法是____________，圖B效果的接種方法是___________，一同學在純化土壤中的細菌時，發(fā)覺培育基上的菌落連成一片，最可能的緣由是__________________（答出一條即可）。稀釋涂布平板法平板劃線法菌液濃度過高（4）在進行分別分解尿素的細菌試驗時，某同學從培育基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落，該同學的試驗結(jié)果產(chǎn)生的緣由可能有______（填序號）①由于土樣不同②由于培育基污染③由于操作失誤④沒有設置比照①②③4.飼養(yǎng)動物常用的植物飼料中含有難溶的植酸鈣等物質(zhì)，很難被動物吸取利用，還影響對其他養(yǎng)分物質(zhì)的利用。若在飼料中添加植酸酶，則能催化其水解成為可以吸取利用的磷酸鹽等。以下是科研人員從作物根部土壤中分別產(chǎn)植酸酶的菌株的過程示意圖。請分析作答。(1)培育基中除了添加植酸鈣以外，應含有__________、__________、水、無機鹽等基本養(yǎng)分物質(zhì)。碳源氮源(2)分別產(chǎn)植酸酶的菌株，需先配制合適的培育基，配制培育基時，在各成分都溶化后和分裝前，要進行的是_________和滅菌。對培育基進行滅菌的常用方法是____________。通常每種稀釋液需涂布___個平板，取其平均值。若將最終一個試管中的菌液每次吸取0.1mL涂布培育后獲得平均值是C，則1g土壤中含有此菌的菌株數(shù)是_______個。調(diào)整pH值高壓蒸汽滅菌3C×106(3)為防止雜菌污染，要對培育基和培育皿等進行_______________，而且須將接種后的培育皿呈__________狀態(tài)放置。(4)接種以前進行的一系列操作，目的是在培育皿表面形成__________。依據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的__________就能大致推想出樣品中的活菌數(shù)。滅菌倒置單個菌落菌落數(shù)5．微生物與人類關系親密。雖然有些微生物能使動植物患病，但多數(shù)微生物對人類是有益的，請回答下列有關問題：(1)下表為兩種微生物的培育基配方。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素瓊脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纖維素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：將上述兩種培育基中的物質(zhì)分別溶解后，均用蒸餾水定容到1000mL。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素瓊脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纖維素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：(1)①假如要進行土壤中分解尿素的細菌的分別，則須要選擇上述哪種培育基？________，該培育基能分別尿素分解菌的緣由是：②在該培育基中可加入________指示劑，依據(jù)指示劑的顏色可鑒定該種細菌能夠分解尿素。③從功能上來看，上述兩種培育基均屬于________培育基。A培育基培育基中尿素為唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生長繁殖酚紅選擇(2)把牛肉膏蛋白胨固體培育基倒入平板，等培育基冷凝后，應將平板________放置，這樣做的目的是可防止________________________造成污染。(3)微生物接種的方法很多，平板劃線法操作結(jié)束時，為什么仍須要灼燒接種環(huán)？____________________________________。(4)微生物培育過程中還有什么方法或步驟要防止其他微生物污染？________________、_______________________、________________。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素瓊脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纖維素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：倒過來皿蓋上的水珠落入培育基殺死接種環(huán)上殘留菌種，避開污染環(huán)境和感染操作者培育基滅菌接種環(huán)境滅菌接種過程無菌操作6.尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下試驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌(目的菌)。培育基成分如下表所示，試驗步驟如圖所示。請分析回答問題：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g瓊脂15g將上述物質(zhì)溶解后，用自來水定容到1000mL(1)培育基中加入尿素的目的是_____________，這種培育基屬于________培育基。(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培育基中的________和________，試驗須要振蕩培育，緣由是________________________。(3)在以尿素為唯一氮源的培育基中加入___________，細菌合成的_