枸杞多糖對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響

腫瘤患者在接受放射線和化療藥物治療時(shí),射線和藥物對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有抑制作用,致使機(jī)體的免疫功能進(jìn)一步下降,影響了治療效果,并可導(dǎo)致一些不良反應(yīng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者免疫功能下降常伴隨一些細(xì)胞因子水平的變化,如IL-2、IL-12、IFN、TNF等[4]。所以,解決腫瘤患者免疫功能低下問(wèn)題成為治療腫瘤非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

最近,國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出生物反應(yīng)調(diào)節(jié)(BRM)的概念,強(qiáng)調(diào)在腫瘤放化療及手術(shù)治療的同時(shí)應(yīng)用BRM不但能提高患者的免疫功能,還可減輕上述治療對(duì)免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)的損害,從而提高治療效果。在我國(guó),中藥取自天然,來(lái)源廣泛,容易獲得,不良反應(yīng)小。為此,本實(shí)驗(yàn)試圖對(duì)枸杞多糖免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究,研究其對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖及功能的影響。摘要為研究枸杞多糖(LBP)對(duì)正常人外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響，通過(guò)無(wú)菌分離人外周血淋巴細(xì)胞,加入植物凝集素(PHA)和不同質(zhì)量濃度LBP,MTT法檢測(cè)其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響;ELISA法檢測(cè)LBP作用后淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)情況，來(lái)研究枸杞多糖對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖及功能的影響。關(guān)鍵詞枸杞多糖;外周血;淋巴細(xì)胞;增殖;抗腫瘤;免疫功能一.實(shí)驗(yàn)原理枸杞多糖(LBP)是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成。而實(shí)驗(yàn)證明多糖成分(如云菇多糖、靈芝多糖等)可通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的[1-2],目前對(duì)于枸杞多糖抑制腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用及免疫機(jī)制尚不十分清楚。PHA是T細(xì)胞非特異性有絲分裂原,能與T細(xì)胞表面CD3/TCR復(fù)合體結(jié)合,導(dǎo)致包括CD3+、CD4+、CD8+以及LAF-1等細(xì)胞表面分子磷酸化,通過(guò)激活PKC途徑引起細(xì)胞活化。TNF-α能夠直接殺死病毒和腫瘤,在CD8+T的成熟階段發(fā)揮著重要的信號(hào)作用,TNF-α缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生下降,影響其轉(zhuǎn)化為記憶性T細(xì)胞?？梢?jiàn),TNF-α除了對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接毒性和生長(zhǎng)抑制作用外,還可以通過(guò)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用抵抗腫瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)主要是以枸杞多糖為材料來(lái)研究其對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)增強(qiáng)免疫力的抗腫瘤藥物提供參考。二、實(shí)驗(yàn)材料與分組

1.材料健康人外周血采自20～30歲健康志愿者。枸杞多糖由本校實(shí)驗(yàn)中心從優(yōu)質(zhì)枸杞子中分離提取,純度為99%。RPMI-1640為Gibco公司產(chǎn)品。植物凝集素（PHA)、MTT試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、ELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物工程有限公司。淋巴細(xì)胞分離液為上海生化試劑二廠產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品。2.

分組據(jù)實(shí)驗(yàn)孔中加入枸杞多糖質(zhì)量濃度的不同以及加入或不加PHA將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、PHA組、枸杞多糖組、PHA＋枸杞多糖組。三、實(shí)驗(yàn)方法

1.

人外周血淋巴細(xì)胞的分離和增殖反應(yīng)取健康人外周血約5mL,肝素抗凝,加入等體積PBS混勻,用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)取白細(xì)胞層用PBS洗滌2次,加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。未貼壁細(xì)胞為淋巴細(xì)胞,將其重懸于培養(yǎng)液中,2%臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞存活率>95%,調(diào)整濃度為2×109L-1。加入96孔板中,每孔100μL,實(shí)驗(yàn)孔加入不同質(zhì)量濃度的枸杞多糖,加入或不加PHA,枸杞多糖終質(zhì)量濃度分別為100,80,60,50μg/L,每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)72h,各孔加入MTT(5g/L)20μL,培養(yǎng)過(guò)夜,離心棄去培養(yǎng)上清,每孔加入DMSO150μL,混勻后以測(cè)定波長(zhǎng)570nm、參考波長(zhǎng)620nm檢測(cè)各孔吸光度(A)值,并計(jì)算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。將所測(cè)及計(jì)算結(jié)果記錄于表一。

表一各組外周血淋巴細(xì)胞增殖情況比較（x±s,n=4）

組別濃度/（㎎/L）A值增值指數(shù)對(duì)照組－

PHA組0.050

枸杞多糖組50

60

80

100PHA＋枸杞多糖組50+0.050

60+0.050

80+0.050

100+0.0502.TNF-α的測(cè)定按1項(xiàng)方法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,所得到的培養(yǎng)上清用ELISA法測(cè)定TNF-α水平,在酶標(biāo)測(cè)試儀上測(cè)定570nm處A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的量。將所測(cè)及計(jì)算結(jié)果記錄于表二。表二各組外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α情況比較組別濃度/（㎎/L）TNF-α（μg/L）對(duì)照組－

PHA組0.050

枸杞多糖組50

60

80

100（x±s,n=4）

3.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示。四、結(jié)果預(yù)測(cè)

1.枸杞多糖對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在50~100mg/L質(zhì)量濃度下,枸杞多糖可單獨(dú)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化和增殖,并且在PHA的作用下枸杞多糖可顯著促進(jìn)PHA活化的淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01)。2.枸杞多糖對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的影響采用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PHA對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α沒(méi)有明顯影響(P>0.05),經(jīng)枸杞多糖作用后,淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α水平顯著升高(P<0.01),且有明顯的量效關(guān)系。五、結(jié)果分析1.枸杞多糖與PHA協(xié)同作用使得淋巴細(xì)胞顯著增殖，可能是因?yàn)殍坭蕉嗵菑?qiáng)化了PHA活化作用,促進(jìn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入增殖周期而發(fā)生增殖。2.如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此不同或相反，可能與以下原因有關(guān)：人體的個(gè)體差異使得其免疫功能不同，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)驗(yàn)操作手法及過(guò)程也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。參考文獻(xiàn)[1]何燕,吳雄志.中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].四川中醫(yī),2001,19(2):1