高分子物理何曼君第二章4

五、分子量分布的測定

－凝膠色譜法

GelPermeationChromatography1.基本原理2.分子量標定曲線3.普適曲線4.凝膠色譜的注意事項要求：重點掌握凝膠色譜基本原理與數據處理凝膠色譜的發(fā)展簡史

凝膠色譜是十幾年前才發(fā)展起來的一種新型液體色譜，是色譜中最新的分離技術之一．它的分離基礎主要根據溶液中分子體積(流體力學體積)的大?。枚嗫仔晕镔|來按分子體積大小進行分離，在五十年前就已有報道．McBain用人造沸石成功地分離氣體分子和低分子量的有機化合物．1953年wheaton和BauMan用離子交換樹脂按分于量大小分離了苷、多元醇和其它非離子物質．1959年Porath和Flodin用交聯(lián)的縮聚葡糖制成凝膠來分離水溶液中不同分子量的試樣．這類凝膠立即以商品名稱“Sephadex”出售，在生物化學領域內得到非常廣泛的應用，這是凝膠色譜技術在水溶性試樣的分離中首次取得推廣應用，成為生物化學中一項常用的分離手段．在生物化學領域內，這種分離技術被命名為凝膠過濾．有機溶劑體系的凝膠色譜首先需要解決適用于有機溶劑的凝膠的制備問題．凝膠的制備花了幾年功夫才獲得成．1964年，Moore以苯乙烯和二乙烯苯在不同的稀釋劑存在下制成一系列孔徑不同的凝膠，這些凝膠可以在有機溶劑中分離分子量從幾千到幾百萬的試樣．翌年，Maly以示差折光儀為濃度檢測器、以體積指示器為分子量檢測器制成凝膠色譜儀，這些凝波和儀器立即被制成商品出售．這樣，凝膠色譜技術很快就在高分子科學領域內被廣泛應用，作為一種快速的分子量和分子量分布測定方法，取得很好結果，并被譽為近年來這方面一項技術上的重要突破．

優(yōu)點：①快速（測定周期短）②操作簡便③數據可靠、重復性好，比以往的分級快十幾倍到幾十倍它已成為高化、生化、有機化學領域的一個重要的分離和分析手段由于歷史原因，凝膠色譜的理論發(fā)展、實驗技術和應用開發(fā)主要在生物化學和高分子化學領域內．對這項新技術，不同的工作者采用了不同的命名，這就造成了文獻中命名方面的混亂．文獻中用過的名稱有：凝膠過濾(gelfiltration)，分子篩過濾(molecularsievefiltration)，分子篩色譜(molecularsievechromatography)，排除色譜(exclusionchromatography)，分子排除色譜(molecularexclusionchromatography)，凝膠排除色譜(gelexclusionchromatography)．有限擴散色譜(restricteddiffusionchromatography)，凝膠擴散色譜(geldiffusionchromatography)．體積色譜(stericchromatography)，凝膠滲透色譜(gelpermeationchromatography)，液體排除色譜(Liquidexclusionchromatography)，凝膠色譜(gelchromatography)和體積排除色譜(sizeexclusionchromatography)．一般來說，在生物化學界中常用的名稱是凝膠過濾，在高分子化學界中常用的名稱是凝膠滲透色譜(簡稱GPC)．眾說不一，主要是體積排除法體積排除法：限制擴散機理流動分離機理1.基本原理基本原理①分離的核心部件是一根裝有高孔性載體的色譜柱，柱中充滿溶劑。②高孔性載體表面和內部有著各種大小不同的空洞和通道色譜柱示意圖

（內含載體與溶劑）多孔性載體（填料）載體顆粒形貌圖，尺寸在5um-50um左右顆粒表面形態(tài)結構圖孔尺寸在幾-幾十納米V0：粒間體積Vi：孔內體積柱內全部空間體積：V0+Vi全部由溶劑充滿。③高分子試樣位于柱頂，利用溶劑進行恒速淋洗:溶質隨溶劑帶動向下運動。最后流經整個色譜柱被淋洗出來。柱后收集的帶溶質的溶液稱為淋洗液從淋洗開始到溶質分子被帶出所收集的淋洗液體積稱為該溶質分子的淋出體積Ve

:Ve當試樣隨溶劑進入柱中后（1）比載體的最大的孔還要大的分子只能隨溶劑流經載體顆粒之間，走的路徑最短，最先淋洗出。大尺寸分子的淋出體積為V0（被排除體積）Ve（2）尺寸小于所有空洞的小分子除了走顆粒間、還要進入顆粒內的孔，走的路徑最多，所以最后被溶劑沖洗出來，淋出體積為V0＋Vi溶劑的淋出體積Ve是V0＋Vi（3）尺寸居中的分子除了走顆粒間的路徑，還可以進入部分孔洞，流經路徑在大尺寸分子與小尺寸分子之間，在兩者之間被淋洗出來淋出體積：

K：分配系數，溶質分子能夠進入的孔體積與Vi之比。不同尺寸的分子，進入孔洞的能力不同，K值不同。④總之，體積大小不同進入孔洞的能力不同，流經路徑長短不同，淋洗出色譜柱的順序不同：分子量大的淋出體積小，分子量小淋出體積大由此，尺寸不同的分子得以分級。排除體積理論凝膠滲透色譜分離過程凝膠滲透過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠凝膠色譜儀流程濃度檢測裝置橫坐標：淋出體積縱坐標：溶液濃度凝膠滲透色譜圖：如何轉為分子量分布曲線？（濃度、分子量）需要測量各個級分分子量的大小與含量。色譜柱的擴展效應凝膠滲透色譜是將各個級分按分子量大小不同分離開來，還不是分子量分布圖。⑤測定不同淋出體積高分子的分子量，將濃度-淋出體積曲線轉化為分子量分布圖

直接法：淋洗液直接經過粘度計或光散射檢測器測量各級分的分子量間接法：求M-Ve的關系？2.分子量－淋出體積標定曲線作法：一組分子量不等的單分散試樣作為標準樣品，分別測量其淋出體積與相應的分子量。凝膠色譜：測淋出體積Ve，試樣濃度（紫外、紅外、折光指數儀）其他儀器測分子量（粘度計、光散射與之聯(lián)用）Ma：滲透極限：V0的測定Mb：接近V0＋Vi分離范圍：利用標定曲線，已知Ve則可求待測試樣的M。最終可求試樣的分子量與分子量分布結構不同的高分子，分子量相同，在溶液中尺寸不同，淋出體積不同，lnM-Ve曲線不同，因此，不同結構的高分子須重新標定lnM-Ve曲線。困難：很多高分子難以獲得分子量單分散樣品，lnM-Ve曲線難以標定

能否尋求一個與分子量相關參量，其值僅和分子的尺寸相關，那么，分子結構不同的高分子可以適用同一條標定曲線（不同結構曲線重合）?3.普適標定曲線Einstein粘度公式普適標定曲線Universalcalibrationcurve

普適標定曲線兩種高分子的lgM-Ve曲線不重合，但普適曲線重合利用普適曲線測分子量分布普適曲線已標定測量待測試樣的淋出體積，利用普適曲線求出普適曲線的偏離情況原因：分離機理受到干擾。①不良溶劑②溶劑極性小于載體的極性③溶質與載體的相容性不好對于待定體系，必須經過證明方可使用普適曲線4.凝膠色譜注意事項載體、溶劑的選用分子量－淋出體積的標定普適標定曲線試驗數據處理（1）試驗過程①色譜柱的制備：——②淋洗（測Ve與濃度）——③分子量的測定——④試驗數據處理葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠是應用最廣泛的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質量中所占的百分數叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網狀結構越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網狀結構越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。它與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達到的。瓊脂糖凝膠的化學穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。色譜柱中凝膠種類與選擇－－－一般了解即可聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時不會有凝膠物質被洗脫下來。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團。疏水性凝膠常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號，具有大網孔結構，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好。多孔玻璃珠多孔玻璃珠的化學和物理穩(wěn)定性號，機械強度高，不但抵御酶及微生物的作用，還能夠耐受高溫滅菌和較強烈的反應條件。缺點是親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特性性吸附，而且可供連接的化學活性基團也少。其他載體由聚丙稀酰胺和瓊脂糖混合組成的載體已投入應用。它的特點是載體既有羥基又有酰胺基，并且都能單獨與配基使用。但這類載體不能接觸強堿，為了避免酰胺水解，使用溫度不能超過40℃。GPC柱，填料為苯乙烯，二乙烯基苯多孔滲水性的凝膠，其粒子的孔徑分布很寬，因此具有很寬的線形范圍。有三種尺寸