質(zhì)粒DNA的小量制備

基因工程實(shí)驗(yàn)?zāi)K一、質(zhì)粒DNA的提取和鑒定二、目的基因的獲得和重組載體的構(gòu)建三、感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及重組子篩選四、目的基因在E.coli中表達(dá)與SDS鑒定一、質(zhì)粒DNA的提取和鑒定實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的小量制備實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA的電泳鑒定實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒DNA的酶切質(zhì)粒(plasmid)的基本概念：1）是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子。2）存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。背景知識(shí)復(fù)習(xí)4）絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，以超螺旋形式存在。3）絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型的，但酵母的“殺傷質(zhì)粒”是RNA。5）分子大小：1-300kb。質(zhì)粒的基本特征：自主復(fù)制性不相容性可轉(zhuǎn)移性

攜帶特殊的遺傳標(biāo)記嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒

根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)(拷貝數(shù))多寡，質(zhì)粒可分為：

質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)，進(jìn)行自主復(fù)制。自主復(fù)制性：

1-3拷貝/cell，復(fù)制受細(xì)胞核控制，伴隨染色體DNA復(fù)制而復(fù)制。如：pSC101、p15A。1）嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)：

加入氯霉素（終濃度10-170g/ml）抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，可達(dá)3000拷貝/cell。2）松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)：如：pMB1、ColE1。10-200拷貝/cell，復(fù)制不受細(xì)胞核控制，染色體DNA復(fù)制停止時(shí)，仍可進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒DNA的提取方法：氯化銫密度梯度離心法堿裂解法沸水浴法氯化銫密度梯度離心法：

質(zhì)粒純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染；堿裂解法：

質(zhì)粒純度低、快速、操作簡(jiǎn)便；沸水浴法：質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。

在強(qiáng)堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當(dāng)溶液恢復(fù)中性時(shí)，DNA雙鏈復(fù)性。原理：堿裂解法是最常用的質(zhì)粒DNA提取方法。12在變性后雙鏈不分離、復(fù)性快。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA：13強(qiáng)堿性

變性后雙鏈分離、難以復(fù)性而形成纏繞結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，離心時(shí)沉淀。染色體線性DNA、有缺口的質(zhì)粒DNA：14本實(shí)驗(yàn)的目的掌握質(zhì)粒DNA提取的堿裂解方法。15實(shí)驗(yàn)試劑1）LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨5g/L酵母提取物10g/LNaCl用5NNaOH調(diào)pH至7.0，121℃高壓滅菌20min。16用無(wú)菌H2O配置100mg/ml，-20℃保存；在LB中的終濃度為100g/ml。2）Amp貯存液：174）STE：10mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）0.1mol/L

NaCl3）TE：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA185）溶液I：50mmol/L

葡萄糖25mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）121℃高壓滅菌20min，4℃保存。196）溶液II：0.2mol/L

NaOH1%SDS注意：配0.2mol/L

NaOH時(shí)，臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。207）溶液III：5mol/LNaAc60ml冰HAc11.5mlH2O28.5mlpH為4.8，4℃保存。218）25:24:1酚:氯仿:異戊醇9）氯仿10）無(wú)水乙醇11）70%乙醇2210）RNase：10mmol/L

Tris-HCl（pH7.5）15mmol/L

NaCl10mg/mlRNase11）質(zhì)粒貯存液：含20g/mlRNase的TE或H2O231）葡萄糖

增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力的作用而降解（震蕩）。各種試劑的作用：242）EDTAMg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止DNA被降解。253）NaOH-SDS

NaOH是強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。

SDS是離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白質(zhì)-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性沉淀。4）NaAc-HAc緩沖液

用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。

高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。5）乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。

一般使用2倍體積的無(wú)水乙醇。286）RNaseA

降解殘留的RNA，以免提取后的DNA中含有小分子RNA。297）TE緩沖液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），利于以后操作。

但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中（現(xiàn)已少用，多用各種商品化的層析柱純化DNA)。8）酚-氯仿-異戊醇

蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。實(shí)驗(yàn)步驟3）將細(xì)菌沉淀重懸于0.5mlSTE中，12000rpm離心1min，棄上清。1）將菌落接種于2ml含100g/ml的LB中，37℃振搖過(guò)夜。2）取1.5ml培養(yǎng)物于1.5mlEppendorf管中，于4℃離心12000rpm1min，棄上清。4）將細(xì)菌沉淀重懸于100l4℃預(yù)冷的溶液I中，蓋緊管口，vortex劇烈振蕩，使細(xì)菌沉淀完全分散，放置5-15min。5）加200l溶液II，蓋緊管口，快速顛倒Eppendorf管5次，使管整個(gè)內(nèi)表面均與溶液II接觸（不要振蕩），冰上放置5-10min。6）加入150l4℃預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10sec，冰上放置5min。7）4℃離心15000rpm5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。8）加入等量酚-氯仿-異戊醇，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。9）加入等量氯仿，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。10）加入2倍體積無(wú)水乙醇，振蕩混勻，室溫放置5min（或-70℃放置30min），4℃離心15000rpm10min，小心吸去上清，將附于管壁的液滴除盡。11）用4℃預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀1-2遍，按上述方法除盡上清，37℃干燥5-10min。12）用含RNase的TE或H2O溶解DNA，貯存于-20℃。

許多公司都研制出成套的商品化質(zhì)粒提取試劑盒，原理大都依照堿裂解法，但在純化步驟上采用柱層析，實(shí)驗(yàn)步驟參考相應(yīng)的Protocol。37微量加樣器的使用方法3、將吸頭浸入待移取的液體液面下2-3mm處，慢慢松開(kāi)按鈕，液體在大氣壓的作用下進(jìn)入吸頭內(nèi)。待吸入要求量的液體后，將加樣槍撤離液面，擦去吸頭外側(cè)的液體，注意不能接觸吸頭尖部。1、將加樣槍刻度或讀數(shù)調(diào)至所需定量吸取的液體量值，并裝上合適的吸頭。2、將按鈕壓至第一停點(diǎn)位置（有明顯的阻滯感）并保持，以擠出吸頭內(nèi)空氣，形成吸頭內(nèi)負(fù)壓。385、繼續(xù)按住按鈕，撤出加樣槍，將吸頭棄于特定的盛污染吸頭的器皿中，松開(kāi)按鈕至起始位置，將加樣槍豎直懸掛在加樣槍架上。4、將加樣槍移至待加入液體的容器，讓吸頭位于容器液面的近上方。輕輕壓下按鈕至第一停點(diǎn)位置，讓液體緩緩流出。待液體將流盡時(shí)，繼續(xù)將按鈕下壓至第二停點(diǎn)位置，并讓吸頭尖部輕輕接觸液面上方的容器壁，以免產(chǎn)生氣泡。402、要保證在整個(gè)吸液過(guò)程中，吸頭尖端要一直處于液面之下，即防止吸空造成吸樣不準(zhǔn)確。1、加樣前，一定要檢查吸頭是否上緊，以免液體漏出或取液不準(zhǔn)。3、吸取液體完成后排出液體之前，一定要擦去吸頭四周的液體，特別是在取液量較少時(shí)尤其要注意這一點(diǎn)，但要防止接觸吸頭尖端。注意事項(xiàng)：415、排出液體時(shí)，在液體將排盡時(shí)，要輕輕讓吸頭尖端接觸容器壁，以免在加樣的容器中形成氣泡。4、吸取液體和排出液體動(dòng)作都一定要慢，因?yàn)閯?dòng)作過(guò)快時(shí)，液體因表面張力吸附在吸頭壁上，造成移液不準(zhǔn)。所取液體的粘度越高，越應(yīng)該注意這個(gè)問(wèn)題。426、加樣完成后，應(yīng)在棄去使用過(guò)的吸頭后，方才松開(kāi)按鈕至起始位置，以免吸頭內(nèi)的殘留液體回吸到槍頭，造成交叉污染。7、注意使用一次性吸頭，避免交叉污染。8、如不使用，要把加樣槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧。。43一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙蠖?shí)驗(yàn)設(shè)備及要求三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理五、分析與討論實(shí)驗(yàn)報(bào)告的內(nèi)容44提質(zhì)粒步驟1.室溫10000xg1min離心收集菌體2.加入250ulSolutionI/RNaseA充分重懸菌體3.加入250ulSolutionⅡ并輕柔顛倒混勻多次直到液體清亮。2min室溫孵育。4.加入350ulSolutionⅢ并顛倒離心管多次使充分混勻，直到有白色絮狀沉淀產(chǎn)生。5.室溫，≥13000xg，15min離心6.小心吸取上清到HiBind柱中（每次700ul），室溫，10000xg，1min離心，直到所有上清都過(guò)了柱7.加入