青霉素培養(yǎng)基優(yōu)化

青霉素生產(chǎn)的培養(yǎng)基優(yōu)化的具體實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原理一個(gè)批發(fā)酵(流加發(fā)酵):可以分為生長(zhǎng)期和產(chǎn)物形成期兩個(gè)階段。第一階段:控制菌體的生長(zhǎng),目的是使長(zhǎng)好的菌體能夠處于最佳的產(chǎn)物合成狀態(tài),即如何控制有利于微生物催化產(chǎn)物合成所需酶系的形成.。第二階段:控制產(chǎn)物的合成;找出影響反應(yīng)速度變化的主要因素并加以控制使產(chǎn)物的形成速度處于最佳或底物的消耗最經(jīng)濟(jì)。生產(chǎn)青霉素的菌種目前，國(guó)內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉菌。青霉素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗(yàn)成品包裝前體發(fā)酵階段提取階段前體物質(zhì)

前體：某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入而有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136青霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長(zhǎng)期青霉素分泌期菌絲自溶期青霉素發(fā)酵培養(yǎng)基成分：碳源：青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。氮源：可采用玉米漿（0.3%-0.4%）、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機(jī)氮源，及醋酸銨（提供氮源，同時(shí)提供碳源）、氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機(jī)氮源。前體：為生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素G，需要在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它們對(duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次流加方式加入。無機(jī)鹽：包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下。青霉素發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方乳糖----------22.5g,葡萄糖----------7.5g,醋酸銨----------8.0g,Na2SO-----------40.5g,MgSO4?7H2O----------0.25g,FeSO4?7H2O----------0.1g,CuSO4?5H2O----------0.005g,MnSO4?7H2O----------0.02g,CaCl2?2H2O----------0.05g,ZnSO4?7H2O----------0.02g,苯乙酸---------1.0g,蒸餾水---------1000ml,pH6.5121℃滅菌20min碳源PK：乳糖比葡萄糖更優(yōu)越青霉素的生物合成，受糖分解代謝產(chǎn)物的阻遏，如合成青霉素的酰基轉(zhuǎn)移酶就會(huì)被阻遏。在青霉素發(fā)酵過程中，被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌體生長(zhǎng)，但抑制青霉素的合成。被緩慢利用的乳糖，水解成單糖的速度正好符合青霉素生產(chǎn)期合成青霉素的需要，而又不會(huì)產(chǎn)生高濃度的分解產(chǎn)物來抑制青霉素的合成，是生產(chǎn)青霉素的優(yōu)越碳源。但是，由于乳糖價(jià)格較貴，成本較高，故在生產(chǎn)實(shí)踐中常通過間隙或滴加葡萄糖的方法控制培養(yǎng)液中糖的含量，以符合菌體生長(zhǎng)和青霉素生物合成的需要。這樣，在青霉素的生產(chǎn)中，降低了生產(chǎn)成本的同時(shí)，又提高了青霉素的產(chǎn)量。青霉素培養(yǎng)室

培養(yǎng)基優(yōu)化步驟：1、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:按照正交表配制50ml。(三組:每組配制一種培養(yǎng)基,各接種一瓶,250ml三角瓶裝液量為50ml)2、搖瓶培養(yǎng):從一級(jí)斜面菌株接種到三角瓶液體培養(yǎng)基,25℃200rpm培養(yǎng)6-7天,可進(jìn)行青霉素的效價(jià)測(cè)定。3、金黃色葡萄球菌菌懸液的制備:將37℃培養(yǎng)16-18h的斜面菌種,用0.9%生理鹽水洗下，菌懸液稀釋至波長(zhǎng)650nm透光率為20%的溶液,需要12ml。4、生測(cè)平板的制備:生測(cè)培養(yǎng)基400ml,加入適當(dāng)稀釋的金黃色葡萄球菌后,制成3*6+2個(gè)平板。5、青霉素發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定:發(fā)酵結(jié)束后5000rpm離心5min．每個(gè)被測(cè)樣品用3套平皿進(jìn)行測(cè)定；37℃培養(yǎng)18-24h后,量取抑菌圈直徑的大小。6、填正交實(shí)驗(yàn)表格,確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。正交實(shí)驗(yàn)表特點(diǎn)（1）任何兩因素之間的都是全面實(shí)驗(yàn)，從而保持了可比性。即任何兩個(gè)因素的各種不同水平的搭配在實(shí)驗(yàn)中都出現(xiàn)了，并且出現(xiàn)了相同的次數(shù)。（2）任一因素個(gè)水平的重復(fù)次數(shù)相等。（3）絕大多數(shù)正交表中各列是等價(jià)的，可以任意取用。因此，正交表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常易于分析，以至于不需要進(jìn)行復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)計(jì)算，就可直接求出各因素影響的大小、效應(yīng)的變化趨勢(shì)等。針對(duì)三因子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)乳糖----------22.5g

或葡萄糖----------7.5g醋酸銨----------8.0g苯乙酸---------1.0g青霉素培養(yǎng)基因子水平表

因子水平乳糖/葡萄糖醋酸銨苯乙酸120/10g7.0g0.7g222.5/7.5g8.0g1.0g325/5g9.0g1.3g設(shè)計(jì)適合的正交表由于是三因子三水平，可選用L9(34)將乳糖/葡萄糖、醋酸銨、苯乙酸分別安排在第2、3、4列，第1列為空列。為了優(yōu)化產(chǎn)青霉素的培養(yǎng)基，即比較各培養(yǎng)基產(chǎn)生的青霉素的含量，就可以確定最佳優(yōu)化培養(yǎng)基成分。本設(shè)計(jì)方案用抑菌圈大小來間接測(cè)定青霉素產(chǎn)量。

正交實(shí)驗(yàn)表：

列號(hào)試驗(yàn)號(hào)12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）123456789123123123111222333123231312132213321k1k2k3極差R

列號(hào)試驗(yàn)號(hào)12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k1k2k3極差R實(shí)驗(yàn)分析一：試驗(yàn)的目的試驗(yàn)的目的：

產(chǎn)黃曲霉的效價(jià)，需要測(cè)定抑菌圈大小。從試驗(yàn)中可以看出：

乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸銨各自在水平一的時(shí)候抑菌圈最大。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析方法分為：極差分析法和方差分析法兩種。極差分析法：也稱直觀分析法，優(yōu)點(diǎn)是直觀、簡(jiǎn)單，適用范圍廣，因此在正交設(shè)計(jì)中最常用；缺點(diǎn)是分析結(jié)果較粗糙，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在混雜現(xiàn)象時(shí)，往往給出錯(cuò)誤結(jié)論。方差分析法：優(yōu)點(diǎn)是可通過統(tǒng)計(jì)分析的方法排除實(shí)驗(yàn)誤差的干擾，得出比較科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論；缺點(diǎn)是計(jì)算復(fù)雜；在多因子實(shí)驗(yàn)中主要用于判斷因子的主次。

列號(hào)試驗(yàn)號(hào)12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k11.9291.9081.858k21.8601.741.701k31.6761.8161.906極差R0.2530.1680.205實(shí)驗(yàn)分析二：比較因子極差大小在試驗(yàn)選擇的水平范圍內(nèi)。極差可以直接反映各個(gè)因素選取的水平變化對(duì)優(yōu)化目標(biāo)影響的大小。極差越大，說明該因子的水平變動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變動(dòng)越大，即該因子對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，從而可以按極差的大小來決定因子的主次順序。本實(shí)驗(yàn)各因素極差的比較重，可根據(jù)極差的大小順序排除因素影響的主次順序：乳糖/葡萄糖>苯乙酸>醋酸銨實(shí)驗(yàn)分析三：

確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配比

k1、k2、k3反映了因子各水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因而最大的k值對(duì)應(yīng)于最好的水平乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸銨各自在水平一的時(shí)候抑菌圈最大。本實(shí)驗(yàn)較適宜的配比為：

乳糖