血紅蛋白的提取和分離(上課)

一、血紅蛋白的提取和分離1、血液有哪些成分血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。2、血紅蛋白的特點(diǎn)：

用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；豬的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。3、蛋白質(zhì)分離和提取的原理：P64

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。4、蛋白質(zhì)分離和提取的常用方法：①凝膠色譜法（分配色譜法）②電泳（一）凝膠色譜法（分配色譜法）1.概念：

根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。3.凝膠色譜法的原理

①當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;②而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫演示

相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè)（）B（二）緩沖溶液

1.概念:2.作用:

在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

在一定范圍內(nèi)，能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。3.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)。磷酸緩沖液樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟二、實(shí)驗(yàn)操作檸檬酸鈉(1)紅細(xì)胞的洗滌:②洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。①洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心。3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速短時(shí)間離心。6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。1.樣品處理（二）操作過(guò)程洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白；離心速度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。注意：(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：①離心：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色)；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。甲苯層（無(wú)色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次(4)透析：

①過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。

②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。2.粗分離透析過(guò)程動(dòng)畫演示2.凝膠色譜操作:①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。（1）凝膠色譜柱的制作③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

（2）凝膠色譜柱的裝填③凝膠色譜柱的裝填：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（2）凝膠色譜柱的裝填

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：50cm高（2）凝膠色譜柱的裝填1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。（3）樣品加入與洗脫在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功注意：思考下面的問(wèn)題：

讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。

1、在血紅蛋白純化的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。1.樣品的處理——通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液2.樣品的粗分離——經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)3.樣品的純化——通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去4.純度鑒定——SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的程。

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2.原理：3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。

在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖

聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理：

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機(jī)理:（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）鑒定血紅蛋白純度。目的：

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？

教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。

A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小

C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)維持（）基本不變。

A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。

A相同B相反C相對(duì)D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。

A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白BBBA5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。

A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ?/p>

A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）

A無(wú)色