第三章發(fā)酵工藝學(xué)

第三章工業(yè)微生物的菌種選育菌種選育基本內(nèi)容

自然選育或人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再進(jìn)行篩選獲得新的變種或雜種。目的提高生產(chǎn)能力提高產(chǎn)品質(zhì)量開發(fā)新產(chǎn)品解決生產(chǎn)實(shí)際問題防止菌種退化改良菌種的特性方法自然選育、誘變育種雜交育種（原生質(zhì)體融合)分子育種第一節(jié)自然育種在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程，叫自然選育或自然分離。自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、菌種衰退（一）菌種遺傳特性的改變1.異核現(xiàn)象2.自發(fā)突變3.回復(fù)突變

菌種的性狀實(shí)際上是孢子群體的特征。

群體較純的，傳代后變異較少（二）菌種生理狀況的改變

1.變株所占的比例

2.菌種培養(yǎng)基

3.特殊培養(yǎng)條件，菌體的活化狀態(tài)

或阻遏狀態(tài)自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？二、自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。常用的自然選育方法是單菌落分離法單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)單細(xì)胞(孢子)懸液的制備細(xì)菌：轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中培養(yǎng)，獲得分散且生長活躍菌體放線菌和霉菌的孢子：采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子，用濾紙或棉花過濾?？杉尤?.05%分散劑。第二節(jié)誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種.一、誘變劑誘變劑：能夠提高生物體突變頻率

的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{物理誘變劑物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。湖北省輻照中心——輻射源控制臺你相信一株西紅柿一次能結(jié)13000粒果嗎？

你見過能同時(shí)長3000多條黃瓜的黃瓜樹嗎？一棵甜瓜竟然結(jié)了90個(gè)誘人的甜瓜

化學(xué)誘變劑化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣罩。而用電離輻射進(jìn)行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。

太陽能育種近年來研究的新課題。用聚焦陽光間歇地照射植物的種子、幼苗、花粉、芽、或塊莖等，可以促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高產(chǎn)量，同時(shí)可誘發(fā)變異。有的國家稱太陽能育種為“植物光能學(xué)”。目前，以獲得小麥、玉米、大豆、番茄等新類型。照射過的黃瓜種子總產(chǎn)量可提高14%，早期產(chǎn)量可提高17-20%，照射番茄種子獲得的新品種產(chǎn)量比親本高30-50%，而且果實(shí)的質(zhì)量好。宇航（太空）育種利用衛(wèi)星搭載植物種子在太空中宇宙射線的輻射下，生物遺傳物質(zhì)有人類意想不到的各種變異。如辣椒果實(shí)變得特大的太空辣椒。通過衛(wèi)星搭載進(jìn)行植物種質(zhì)創(chuàng)新還在菠菜、黃瓜等植物上開展了試驗(yàn)。太空辣椒好大呀！太空育種成果太空水果櫻桃番茄太空水果番茄系列二、突變誘發(fā)過程前突變：誘變劑造成DNA分子的某一位置結(jié)構(gòu)改變（一）誘變劑接觸DNA分子前細(xì)胞對誘變劑透性、接觸DNA之前細(xì)胞質(zhì)某些組分、酶相互作用影響、基因狀態(tài)等影響誘變效果（二）DNA損失的修復(fù)方式1、光復(fù)活作用2、切補(bǔ)修復(fù)四種酶：核酸內(nèi)切酶——單鏈斷裂

核酸外切酶——切除胸腺嘧啶二聚體（突變部分）DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ——修補(bǔ)DNA連接酶——連接完整雙鏈結(jié)構(gòu)3、重組修復(fù)4、SOS修復(fù)系統(tǒng)：易導(dǎo)致基因突變5、DNA多聚酶的校正作用（三）從前突變到突變修復(fù)系統(tǒng)校正差錯(cuò)：光復(fù)活、切補(bǔ)修復(fù)、DNA多聚酶的校正作用（不利于突變誘發(fā)）引起差錯(cuò)：重組修復(fù)、SOS修復(fù)系統(tǒng)（有利于突變發(fā)生）（四）從突變到突變型表型遲延：突變基因的出現(xiàn)并不等于突變表型的出現(xiàn)，表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象。分離性遲延生理性遲延三、誘變育種方案的設(shè)計(jì)三個(gè)環(huán)節(jié)：突變誘發(fā)

突變株篩選

突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)（一）制定篩選目標(biāo)1、誘變過程：出發(fā)菌種的斜面——選取對誘變劑最敏感菌株單孢子懸浮液制備

孢子計(jì)數(shù)

單菌落分離2、篩選過程：傳種斜面、留種保藏菌種、篩選高產(chǎn)菌株四、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選

確定出發(fā)菌↓菌種的純化選優(yōu)↓出發(fā)菌株性能測定同步培養(yǎng)↓

制備單細(xì)胞（單孢子）懸液↓誘變劑選擇與誘變劑量的預(yù)試驗(yàn)↓ 誘變處理↓平板分離↓計(jì)形態(tài)變異菌落數(shù)、計(jì)算突變率挑選突變菌落純培養(yǎng)↓突變株的初步篩選↓重復(fù)篩選↓搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)選出突變株進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)(一)出發(fā)菌株的選擇1．選純種：①要選擇發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定，波動范圍小菌株②如菌種不純，可采用自然分離或用緩和誘變劑處理2．選產(chǎn)量高的，產(chǎn)孢子早而多，考慮產(chǎn)色素的多少，生長速度快慢等利用發(fā)酵產(chǎn)物合成因素。3.選擇對誘變劑敏感菌株(二)處理菌懸液的制備單細(xì)胞或單孢子菌懸液的制備在誘變育種中要求待處理的菌懸液呈分散的單細(xì)胞或單孢子狀態(tài)，這樣一方面可以均勻地接觸誘變劑，另一方面又可避免長出不純的菌落。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學(xué)誘變劑處理，因處理時(shí)

pH值會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或?yàn)V紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達(dá)90％以上，供誘變處理較為合適。(三)誘變處理

誘變劑的選擇1、遺傳不穩(wěn)定菌株，采用溫和的或已見效果的誘變劑；遺傳穩(wěn)定，采用強(qiáng)烈、不常用、誘變譜廣的誘變劑。注意變換誘變劑2、注意選擇適合的，考慮誘變劑本身的特點(diǎn)。如：紫外線作用于DNA分子的嘧啶堿基；亞硝酸作用于DNA分子的嘌呤堿基。3、選擇最適劑量。低劑量誘變劑可能更有利于高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定。影響誘變效果因素1、出發(fā)菌株的遺傳特性2、誘變劑3、菌種的生理狀態(tài)4、被處理菌種的預(yù)培養(yǎng)條件5、誘變處理外界條件

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個(gè)過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。五、篩選的方法隨機(jī)篩選：搖瓶篩選法、瓊脂塊篩選法

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。1、初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選①降低終產(chǎn)物濃度：篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型、篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株②篩選抗反饋突變菌株：篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株、利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株2.次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選

1.利用營養(yǎng)缺陷型篩選2.篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株3.篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株4.篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株5.篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株6.篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株7.篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株8.篩選自身所產(chǎn)生的抗生素抗性突變株?duì)I養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。其變異前的菌株稱為野生菌株。利用營養(yǎng)缺陷型篩選次級代謝物高產(chǎn)菌株的篩選過程：先進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，選出對抗生素發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響的初級代謝產(chǎn)物，據(jù)此誘變出相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型，然后再誘發(fā)回復(fù)突變或?qū)⒁吧途暾T變成另一營養(yǎng)缺陷型，再與之雜交。第三節(jié)雜交育種指兩個(gè)不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。特點(diǎn)：1、定向育種

2、對誘變劑敏感

3、技術(shù)要求高，應(yīng)用受限制一、常規(guī)的雜交育種1、遺傳標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型）2、異核體：兩個(gè)直接親本菌株經(jīng)過細(xì)胞間接合而形成一條菌絲里含有兩個(gè)遺傳特性不同的細(xì)胞核。3、雜合二倍體4、染色體交換和單倍化二、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）

1.標(biāo)記菌株的篩選

2.原生質(zhì)體的制備

3.原生質(zhì)體的融合與再生聚乙二醇（PEG）－脫水劑助融劑

Ca2+－提高融合頻率

4.融合子的選擇原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。影響原生質(zhì)體制備的因素1．菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。2．菌體的培養(yǎng)時(shí)間為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3．酶濃度對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。4．酶處理溫度5．破壁時(shí)的pH值6．滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無機(jī)物。第四節(jié)分子育種基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目