2023年實(shí)驗(yàn)報(bào)告三免疫印跡

實(shí)驗(yàn)三：免疫印跡1原理免疫印跡又稱Western印跡（WesternbIotting），與DNA的Southern印跡技術(shù)相相應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體（通常為NC膜），然后用探針檢測(cè)特異性組分。不同的是,Westernblotting所檢測(cè)的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反映。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn),具有從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè),以及從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)成標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。目前,Westernblotting廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)的研究。免疫印跡可提成兩個(gè)環(huán)節(jié)：蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至固相基質(zhì);特異性抗體檢測(cè)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移通常由電泳實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)常用的方法有二：1半干法：將凝膠和固相基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液濕潤(rùn)的濾紙中間，通電10-30分鐘可完畢轉(zhuǎn)移;2濕法:將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，通電45分鐘或過(guò)夜課完畢轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采用濕法轉(zhuǎn)移。免疫印跡用膜通常有硝酸纖維素膜和尼龍膜兩種。大多數(shù)應(yīng)用前者。本實(shí)驗(yàn)也用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，蛋白質(zhì)的檢測(cè)可提成三個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行：一方面，將膜同特異性抗體孵育數(shù)小時(shí)或過(guò)夜，然后將膜同可特異性辨認(rèn)上述抗體（一抗）的第二抗體（二抗）孵育，通常二抗連接有如辣根過(guò)氧化物酶等標(biāo)記物。目的蛋白可由該酶催化的顯色反映在膜上形成有色產(chǎn)物加以檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)用的是酶標(biāo)抗IgG,故不加一抗。2試劑與儀器1試劑（所有試劑均供兩組用）轉(zhuǎn)移緩沖液Tris3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸儲(chǔ)水約8()OmL,調(diào)pH至8.3,定容1000mLTris緩沖鹽溶液(TBS)Tris2.42gNaCI27.750g加蒸飾水約8()()mL,調(diào)pH至7.5,定容1()()0mLTTBSTBS800mLTween-20400p1封閉液及抗體稀釋液脫脂奶粉0.3gTBS100mL.5底物溶液二氨基聯(lián)苯胺(DAB)5.0mgTBS18mLH2O220pl臨用前配6麗春紅總蛋白質(zhì)染色液麗春紅1g4%乙酸100mL1.75%小牛血清生理鹽水小牛血清7.5mL0.85%生理鹽水定容至150mL2.1.8酶標(biāo)抗IgG(1:1500)酶標(biāo)抗IgG0.1mL5%小牛血清生理鹽水定容至150mL2儀器夾心式電泳槽，電泳儀，硝酸纖維素膜，直徑9cm培養(yǎng)皿，剪刀，鑲子,刀片，微量移液槍，普通濾紙3實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)SDS電泳分離所需試劑、儀器以及分離環(huán)節(jié)完全與實(shí)驗(yàn)六相同,故此處從略。不同之處如下：1.1樣品制備:取人血清0.1mL加稀釋5倍的上樣緩沖液0.5ml,振搖后10000rp/5min離心，取80r1上清液加入等體積的樣品緩沖液，在沸水浴中加熱3min。瞬間離心，取上清液上樣。力口樣:拔出梳子用電極緩沖液沖洗樣品槽后加樣。上樣量從左到右為5、20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5四1（從中間分開(kāi)，兩側(cè)對(duì)稱）。電泳:穩(wěn)流I（）mA電泳，當(dāng)溟酚藍(lán)指示劑前沿到達(dá)距底部1cm左右時(shí)，停止電泳。取出膠，將點(diǎn)有樣品的膠條從中間切成兩條，一條用常規(guī)方法染色和脫色，另一條用于轉(zhuǎn)移和酶聯(lián)。3.2轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上（電轉(zhuǎn)移）2.1切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡5min使沒(méi)有氣泡。2.2剪2張濾紙與膠尺寸大小相符，將其與海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。2.3打開(kāi)轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：a.一張浸濕的海綿；b.一張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙；c.用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過(guò)的膠，并小心的趕走濾紙和膠之間的氣泡;d.硝酸纖維素膜，正面對(duì)著膠，在膠和膜的右下角剪一小角,以標(biāo)明方向;e.一張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙;f.一張浸濕后的海綿。2.4小心的合上膠板，并立即放入轉(zhuǎn)移電泳槽中。加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。3.2.5插好電極，注意正負(fù)極方向，膠側(cè)為負(fù)，NC膜側(cè)為正。打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)調(diào)至穩(wěn)壓60v,電泳2h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開(kāi)膠板取出硝酸纖維素薄膜。3.3膜的酶聯(lián)免疫染色用麗春紅溶液檢查轉(zhuǎn)移是否成功，若顯色清楚，用蒸饋水沖洗，TBS洗膜Imino將膜放入培養(yǎng)皿中。加封閉液后在37℃搖床上搖動(dòng)60min。取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min,將膜放入另一個(gè)培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中加入用150ml5%小牛血清生理鹽水配制的1:1500的酶標(biāo)IgG,在冰箱中振蕩過(guò)夜。3.5取出膜，用TTBS洗3次，每次3min,最后用TBS溶液洗1次似去除Tween-20?6將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后,取出膜，將膠制成干板。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果SDS電泳分離結(jié)果（圖1右）上樣量為10川的泳道分離效果較5m的泳道好,共出現(xiàn)4個(gè)較清楚的條帶。顯色后的免疫印跡膜（圖1左）在免疫印跡膜上共檢測(cè)出一條帶C-應(yīng)當(dāng)為球蛋白，相應(yīng)于右圖中的C。人而清雷白10人而清雷白105/ul人而清雷白105/ul圖1：人而清雷白105/ul字分別為每一個(gè)泳道的上樣量（單位/|11）5討論5.1本實(shí)驗(yàn)所用的樣品是人血清，人血清的成分非常復(fù)雜,BioPharmIntcrnationa1（2023）報(bào)道:Me1ecularandCellularProteomics2023年12月號(hào)發(fā)表的一篇論文稱，人血清中已確證的蛋白種類幾乎翻了一番，即達(dá)成490種。這是PacificNorthwestNationalLaboratory（PNNL）的科學(xué)家運(yùn)用液相層析法和質(zhì)譜分析法代替?zhèn)鹘y(tǒng)凝膠電泳法鑒定的成果。這些人血清蛋白涉及了先前在血清中未鑒定出來(lái)的低豐度蛋白，以及尚未明功能的蛋白。由于方法的限制，我們所用的傳統(tǒng)電泳方法主線不也許完全分離。血清中的蛋白重要是由白蛋白與球蛋白所構(gòu)成。健康人的白蛋白與球蛋白的比例為白蛋白約67%,球蛋白約33%。所以圖1右中條帶較深的蛋白質(zhì)（C）應(yīng)當(dāng)為球蛋白，圖1左中被檢測(cè)的條帶（Ci）恰好是這條較深的條帶，說(shuō)明被檢測(cè)的蛋白就是免疫球蛋白G（IgG）0這樣圖1左的免疫反映結(jié)果也得到合理的解釋,但是決定性的結(jié)論應(yīng)從兩種蛋白在SDS—PAGE電泳中的遷移率進(jìn)行分析，但是尚未得到此方面的資料。本實(shí)驗(yàn)所用的免疫印跡方法稱酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）,其方法簡(jiǎn)樸，方便迅速，特異性強(qiáng)。ELISA是由抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保存其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保存其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反映后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反映而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。并且抗原與抗體的結(jié)合，在一定濃度范圍內(nèi)，只有當(dāng)兩者分子比例合適時(shí)，才出現(xiàn)可見(jiàn)反映。IgG即免疫球蛋白G,與IgM和IgA屬三種同種型天然自身抗體。酶標(biāo)記抗體IgG是將酶與抗IgG抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。由于辣根過(guò)氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）活性高，穩(wěn)定，分子最小，純酶容易制備，所以最常用。HRP的催化反映需要底物過(guò)氧化氫（H2O2）和供氫體（DH》。本實(shí)驗(yàn)所用的供氫體DAB（3.3一二氨基聯(lián)苯胺）的反映產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色。由于HRP的底物H?02自身又是酶的克制劑