蛋白質生物合成

Chapter20蛋白質的生物合成

編碼蛋白質的結構基因通過轉錄，將DNA上（基因上）的遺傳信息傳遞給mRNA。mRNA上的核苷酸順序直接決定蛋白質多肽鏈的氨基酸的順序。本章講授的主要內容:mRNA的核苷酸順序是如何編碼氨基酸順序的呢？

蛋白質生物合成的機制是怎樣的呢？一、遺傳信息是如何編碼氨基酸的？

遺傳學實驗證明，三個核苷酸代表一種氨基酸是一種正確的比例，因此每三個核苷酸即為一個氨基酸的一個遺傳密碼。采用突變試驗可以證明:（同時增加三個或減少三個，可得到類似的結果）二、密碼子是如何闡明的？1、用無細胞測活系統(tǒng)檢驗人工合成的或酶促合成的多核苷酸的表達情況●無細胞測活系統(tǒng)：●用單一核苷酸的聚合體，例如poly(U)、poly(A)等作為模板，檢測氨基酸的入情況，證實UUU是Phe的密碼子，AAA是Lys的密碼子。（介紹檢測實驗如何操作）●多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）在密碼子揭示中的作用2、用核糖體結合技術證實了各種密碼子的組成和核苷酸的順序1964年，Nirenberg發(fā)現：◆人工合成的三核苷酸可以起到mRNA模板的作用；◆在無GTP存在下，三核苷酸可以指導相應的氨酰-tRNA（即結合有某種氨基酸的tRNA）結合到核糖體上；◆硝酸纖維素膜能結合氨酰-tRNA而不結合游離的tRNA。

◆由于三核苷酸模板只與一定的tRNA進行密碼子與反密碼子識別，而tRNA又只能與一定

的氨基酸結合。因此，只要有帶放射性標記的氨基酸被膜保留，即可測知模板是什么氨基酸的密碼子(圖)。利用上述方法(包括人工合成的有規(guī)定順序的多核苷酸作模板)于1966年完整地闡明了編碼20種氨基酸61種密碼子，其他三種密碼子UAG,UAA和UGA是蛋白質合成終止信號，即終止密碼子三、密碼子的性質1、密碼子的簡并性（degeneracy）：

★一種氨基酸由幾種密碼子編碼的現象即稱為簡并?！锞幋a一種氨基酸的幾種密碼子稱為同義密碼子（synonyms）?！镏挥蠱et和Trp分別只有一種密碼子。★密碼子的簡并多數是第三位核苷酸有區(qū)別。例如His的密碼子：CAU、CAC；Gln的密碼子：CAA、CAG。

如果已知某多肽的氨基酸序列，根據氨基酸密碼子的簡并性，可推導該肽多種mRNA的序列（圖）2、密碼子幾乎是通用的

密碼子對胞液蛋白質合成系統(tǒng)來說是通用的，但在線粒體蛋白質合成系統(tǒng)中有些例外:

Codon(5'→3')胞液編碼線粒體編碼

AUAIle

MetAUGMetMetUGATerm

TrpUGGTrpTrpAGAArg

TermAGGArg

Term.3、密碼子是不重疊的

密碼子的不重疊和基因的重疊是不相同的（圖）。基因的重疊是由于識讀起點不同即閱讀框不同所造成的（圖）4、方向性5、起始信號是兼職的

在原核生物中，AUG和GUG具有雙重功能，在作為蛋白質合成的起始密碼子時，它們都編碼甲酰-Met；如果出現在信使內部時，它們則分別編碼Met和Val。在真核生物中，只有AUG兼有兩者的功能，都編碼Met。6、密碼子無標點符號

Section2．蛋白質生物合成中的大分子一、mRNAmRNA是蛋白質合成的直接模板，蛋白質的氨基酸順序由mRNA上三聯(lián)體密碼子的順序決定。

在原核生物生物mRNA5’-端起始密碼子前的前導順序有一段富含嘌呤核苷酸順序，能同16SrRNA3’-端的一段富含嘧啶的堿基順序互補,這一特性可以將30S核糖體小亞基結合在鄰近mRNA起始密碼子的特定部位上。與蛋白質合成或起始合成有關。真核生物mRNA5'-端甲基化的“帽”結構可能也與蛋白質合成起始有關。二、tRNAtRNA是氨基酸的載體，以氨酰-tRNA的形式為蛋白質的合成提供氨基酸。它通過反密碼子與密碼子的相互作用，識別mRNA的信息，將其翻譯成氨基酸。1、同功受體

能接受同一種氨基酸的多種tRNA叫做同功受體（isoacceptor）或同功轉移RNA。例如：Val有三種tRNA可以與它結合。這可能與Val有四種密碼子有關，因為其中三種可與三種相應的tRNA結合：RNA反密碼子

密碼子

氨基酸5'IGC3'5'GUU3'ValGACGUCValUACGUAValGUGVal2、tRAN反密碼子的擺動性

擺動性是指一種氨基酸的tRNA上的反密碼子可以同該氨基酸的幾種密碼子配對結合。例如：酵母丙氨酸的4種密碼子

5'－GCU－3',

－GCC－－GCA－可以和酵母丙氨酸t(yī)RNA(tRNAAla)反密碼子5’-IGC-3’配對。酵母tRNAArg的反密碼子5’-ICG-3’能識別精氨酸3種密碼子：5’-CGA-3’，5’-CGU-3’，5’-CGC-3’。

密碼子與反密碼子之間的配對關系反密碼子的擺動性擺動學說認為，除了標準堿基配對外，還有非標準配對。擺動性一般出現在tRNA反密碼子的第一位堿基和密碼子的第三位堿基之間。擺動學說的堿基配對規(guī)律是(圖)：

反密碼子的

密碼子的

第一位堿基

第三位堿基

AUCGGC或UUA或GIU或C或A三、氨酰-tRNA合成酶（氨基酸：tRNA連接酶）1、為什么氨基酸不能直接參入到蛋白質多肽鏈中？

★兩個氨基酸借肽鍵結合是需要能量的，而自由的氨基酸本身是不活潑的。氨基酸本身對它專一的密碼子是不能識別的。2、氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成氨酰-tRNA是氨基酸的激活形式，一種氨基酸只能與它的專一的tRNA結合。氨基酸與它的專一tRNA結合是由專一的氨酰-tRNA合成酶催化的，因此，細胞內至少存在20種不同的氨酰-tRNA合成酶（鏈接），在ATP供能的情況下氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成。

每種氨酰-tRNA合成酶都專一于一種氨基酸和其相應的一種或幾種tRNA。E.coli所有氨酰-tRNA合成酶的結構都已測定，根據這些酶在一級結構和三級結構上的不同(鏈接)以及反應機制的差別（鏈接1）將其分為兩類（鏈接2）。這兩類酶在所有生物中都是相同的。a.E.coliglutamyl-tRNAsynthetase,aclassIenzyme;b.嗜熱菌glyciyl-tRNAsynthetase,aclassIIenzyme.一級結構和三級結構上的不同C-2位連結C-3位連結反應機制的差別根據反應機制的差別將其分為兩類,這兩類酶在所有生物中都是相同的。一分子氨酰-tRNA的合成消耗兩個高能磷酸鍵。氨酰-tRNA合成酶催化的反應分兩步進行：氨基酸的活化(氨酰腺苷酸的形成)：氨基酸＋ATP＋E→氨基酸·AMP·E＋PPi

（當羧基被活化時往往形成?；佘账幔┌滨?tRNA的生成：氨基酸·AMP·E＋tRNA→氨酰-tRNA＋AMP＋E焦磷酸的水解可以推動合成氨酰-tRNA（使反應變得不可逆）：

PPi＋H2O→2Pi△G0’=～﹣29.3kJ.mol-13、氨酰-tRNA合成酶具有校對功能例如：Val和Ile很相似，于是存在這樣一種可能性，即把Val結合到tRNAIle上，并參入到Ile在肽鏈中的部位上。由于Ile-tRNA合成酶能進行校對，能阻止Val的滲入。因為Ile-tRNA合成酶能催化下面的反應：EIle·(Val·AMP)＋H2O→Val＋AMP＋EIle4、氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用一種氨酰-tRNA合成酶必須對一種氨基酸和它的tRNA是高度專一的。這就要求一給定氨酰-tRNA合成酶既能識別給定的氨基酸，又能識別該氨基酸相應的tRNA。這種相互識別是非常重要的，因為這對于保證密碼子的正確翻譯和蛋白質合成的準確性是絕對必要的。在tRNA分子中，某些核苷酸是保守的，因而它們不可能被氨酰-tRNA合成酶用來甄別不同的tRNA。通過對能改變底物專一性的核苷酸變化研究，發(fā)現能被氨酰-tRNA合成酶用來甄別tRNA的核苷酸集中在氨基酸臂和反密碼(包括反密碼子本身)，有些位于tRNA的其他部位(圖b)。圖c是天冬氨酰-tRNA合成酶與被它識別的tRNA以及ATP所形成的復合物的X-射線晶體衍射圖，該圖顯示氨基酸臂和反密碼臂是相互識別的部位。這些研究結果顯示氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用。藍色的點表示在所有tRNA中位置都是相同的核苷酸；桔紅色或綠色是表示能被一種（桔紅色）或多種（綠色）氨酰-tRNA合成酶識別的位點。結構特征而不是順序對某些氨酰-tRNA合成酶的識別來說是重要的。該圖顯示氨基酸臂和反密碼臂是相互識別的部位氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起著“第二套遺傳密碼子”的作用四、核糖體核糖體是蛋白質合成的場所。核糖體是由rRNA和多種蛋白質組裝成的一種結構復雜的大分子結合體。在核糖體的大亞基上有二個不同的部位：氨酰-tRNA接受部位(A部位)；肽基-tRNA結合部位（P部位）。核糖體的結構→多核糖體：在一條mRNA鏈上結合多個核糖體。每個核糖體都能單獨執(zhí)行合成一條同樣的多肽鏈Section3原核生物蛋白質生物合成一、蛋白質合成的起始1、甲酰甲硫氨酰-tRNA的合成

E.coli和其他細菌合成蛋白質的起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸（fMet）。在E.coli細胞內存在兩種可與Met結合的tRNA即tRNAfMet和tRNAmMet。兩種tRNA各司其職。但兩者的反密碼子是相同的（CAU）。

★當Met與tRNAfMet結合后(即Met-tRNAfMet）可被甲酰化（圖）生成fMet-tRNAfMet，可以作為蛋白質合成的起始物：

Met＋tRNAfMet＋ATP→Met-tRNAfMet＋ADP＋Pi

Met-tRNAfMet＋N10-甲酰四氫葉酸→fMet-tRNAfMet＋FH4★當Met與tRNAmMet結合后生成Met-tRNAmMet，不能被甲?；?，只能用于肽鏈的延長反應。甲?；D移酶只能識別Met-tRNAfMet，而不能識別Met-tRNAmMet。

●什么因素能保證fMet-tRNAfMet只能識別起始密碼子AUG,而不能識別信使內的AUG（Met的密碼子）呢？2、起始復合物的形成1)30S起始復合物的形成在E.coli中，業(yè)已證明起始因子參與了30S起始復合物的形成。這些因子是IF-1、IF-2和IF-3。

2)70S起始復合物的形成30S起始復合物的形成創(chuàng)造了與50S核糖體大亞基結合的條件，可以同50S亞基結合形成70S起始復合物。當50S同30S起始復合物結合時，伴隨著GTP的水解，同時釋放出IF-3、IF-1和IF-2。這樣fMet-tRNAfMet就占據著核糖體的P部位。在70S起始復合物形成時，IF-2起著水解GTP的作用，并使30S起始復合物的構象發(fā)生變化，導致了IF-3、IF-1和IF-2的釋放。二．肽鏈的延伸（Elongation）70S起始復合物形成之后，便可發(fā)生肽鏈延伸（Elongation）的循環(huán)反應（圖）。該循環(huán)反應包括三個步驟：■氨?；?tRNA進入到核糖體的A部位；■肽鍵的形成；■移位反應（translocation）。

延長反應需要三種蛋白質因子參與。這些延長因子（Elongationfactors）是：EF-Tu、EF-Ts和EF-G。三、肽鏈合成的終止遺傳學和生物化學研究表明，在mRNA上存在三種終止密碼子：UAG、UAA、UGA。終止密碼子的識別需要特殊的終止因子或釋放因子。在原核生物中，分離到三種與肽鏈合成終止有關的釋放因子(Releasingfactors)：RF-1、RF-2、RF-3。RF-1能識別終止密碼子UAA和UAG；RF-2能識別終止密碼子UAA和UGA；

RF-3是一種GTP結合蛋白，本身對終止密碼子沒有識別能力，但它在與GTP結合后能促進RF-1和RF-2同核糖體結合的能力。當終止密碼子出現在核糖體A部位相對應的地方時，完整的多肽已經移位到P部位。此時終止過程便開始了(圖)。在GTP的存在下，釋放因子識別終止密碼子，并結合到A部位，誘導肽基轉移酶的活性改變，使其具有水解酶活性(或者說這個酶能催化肽基轉移到水分子上而發(fā)生水解反應)。這樣即可水解肽鏈和tRNA之間的酯鍵，從而釋放出完整的肽鏈。然后，釋放因子在GTP水解的情況下從核糖體上釋放出來(RF具有依賴于核糖體的GTPase的活性)，tRNA和mRNA從核糖體上也釋放出來。核糖體的大小兩個亞基隨之解離，并可重新裝配成70S起始復合物。mRNA很不穩(wěn)定，很快就會被降解。四、新合成的多肽鏈經受折疊和加工新生的多肽鏈需要折疊和加工才能成為生物學上活潑的分子。在合成時或合成后，多肽通過側鏈疏水相互作用以及合適的氫鍵、離子鍵、范德華力的形成、折疊成它的天然構象，mRNA一維的遺傳信息轉變成蛋白質的三維結構。蛋白質合成后的加工或修飾(posttranslationalmodifications)包括：①氨基末端和羧基末端的修飾；②信號順序的切除；③個別氨基酸的修飾；④糖基化；⑤輔基的加入；⑥肽鏈的局部水解；⑦二硫鍵的形成等。四、蛋白質合成過程中的能量問題蛋白質生物合成是一個耗能過程，需要消耗ATP和GTP?！預TP主要用于氨基酸的活化(生成氨酰-tRNA)。☆GTP的主要作用不是為生物合成提供能量。

●從蛋白質合成的全過程看，第一個肽鍵的形成至少需要消耗7個高能鍵：▲fMet-tRNAfMet的形成，消耗1分子ATP，即兩個高能鍵；▲第二個氨酰-tRNA的形成；消耗1分子ATP，即兩個高能鍵；

▲70S起始復合物的形成，消耗1分子的GTP；▲氨酰-tRNA進入A部位，EF-Tu的釋放，消耗1分子的GTP；▲移位反應消耗1分子的GTP●以后的肽鏈延長反應，每參入一個氨基酸，消耗4個高能鍵。最后肽鏈合成的終止反應消耗1分子GTP。例如：合成由200氨基酸殘基構成的蛋白質，總共要消耗(7+198×4+1）=800的高能鍵。因此，蛋白質的合成是一個高度耗能的過程。五、GTP在蛋白質合成中的作用實驗表明，GTP的水解與蛋白質合成中所涉及的蛋白質因子的構象改變有關，使這些因子循環(huán)結合到核糖體上和從核糖體上解離下來。當以GTP的類似物鳥苷酰亞胺二磷酸(GDPNP)(圖)代替GTP同EF-Tu結合，EF-Tu·GDPNP復合物攜帶氨酰-tRNA進入到核糖體上后，EF-Tu·GDPNP不能從核糖體上解離下來，因為EF-Tu·GDPNP不能被水解。GTP水解的目的是為了改變EF-Tu的構象，以便它從核糖體解離下來。而且還有實驗表明，當GTP同EF-Tu結合后能增高EF-Tu同氨酰-tRNA以及同核糖體的親和力。當GDP同EF-Tu結合時，它既不能與核糖體結合，也不能與氨酰-tRNA結合。

★23SrRNA幾乎可以肯定參與肽鍵形成的反應，這是因為：●有證據表明RNA能作為催化劑；●RNA是核糖體的主要組分；●核糖體RNA在進化過程中比核糖體蛋白更具高度的保守性；●任何一種核糖體蛋白的缺失并不導致核糖體功能的消失；●能抑制蛋白質合成的抗菌素的抗性突變株是由編碼rRNA的基因而不是編碼核糖體蛋白的基因的突變所致?！馠arryNoller的實驗表明，來自適溫細菌的50S亞基，除去它的95%的蛋白質后，但保留它的完整的RNA，它的活性仍保留80%以上?！餆o義抑制因子阻止翻譯提前終止：能將某種氨基酸的密碼子（“有義”密碼子）轉變成終止密碼子的突變叫做無義突變(nonsensemutation)。這種突變會導致翻譯提前終止(prematureterminationoftranslation)。具有這種突變的生物可以通過某種tRNA基因的突變而得到“挽救”，這種突變的tRNA能識別無義密碼子(nonsensecodon)，因此稱之為無義抑制因子tRNA。這種無義抑制因子tRNA象它的野生型祖先一樣攜帶同一種氨基酸，并在終止密碼上把該氨基酸添加到正在生長著的肽鏈上，從而阻止肽鏈合成的終止。

例如：E.coli琥珀抑制因子(ambersuppressor，叫SU3)是一種tRNATyr，它的反密碼子已從野生型的GUA（它們識讀Tyr的密碼子UAU和UAC）突變成CUA（它可以識別琥珀終止密碼子UAG）。一種叫做SU3＋的E.coli細胞，在一種編碼必需蛋白質的基因上具有致死的琥珀突變，如果Tyr代替原有野生型（正常的）氨基酸參入到該蛋白質中而又不致使其失去活性的話，那么這個突變株是可以成活的。為什么細胞能耐受這樣的突變呢？因為突變的tRNA通常是同工受體的次要成員，而且能與釋放因子競爭終止密碼子。因此抑制因子挽救的突變體比正常的野生型細胞生長緩慢。

六、真核生物蛋白質合成的有關問題真核生物蛋白質的合成雖然比原核生物蛋白質合成要復雜得多，但基本過程是相同的。兩類生物的蛋白質合成的主要差別表現在合成的起始階段?！粽婧松锏鞍踪|合成的起始氨基酸是Met而不是fMet；起始tRNA是tRNAiMet而不是tRNAfMet；起始密碼子只有AUG?！粼谡婧松镏校阎婕熬欧N蛋白質因子參與蛋白質合成的起始(表)。真核生物蛋白質合成起始因子用eIF表示。eIF-2由三個亞基組成：α亞基參與GTP的結合；β亞基與Met-tRNAiMet結合有關；γ-亞基的功能尚不清楚。

①首先，eIF-2在GTP的存在下，將Met-tR