分子克隆工具酶

分子克隆工具酶第一頁，共九十頁，2022年，8月28日在基因工程的實(shí)際操作中，工具酶的使用是一項(xiàng)基本技術(shù)。用于基因工程的工具酶種類繁多、根據(jù)其功能可粗略分為限制酶、連接酶、聚合酶和修飾酶4類。第二頁，共九十頁，2022年，8月28日工具酶類 主要用途限制性核酸內(nèi)切酶 切割DNA分子形成片段DNA連接酶 DNA片段的連接重組大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ 切口平移法標(biāo)記DNA探針T7DNA聚合酶 DNA序列測定分析TaqDNA聚合酶 PCR體外擴(kuò)增技術(shù)多核苷酸激酶 末端標(biāo)記法制備探針S1核酸酶 去除雙鏈DNA的局部單鏈常用工具酶與基因克隆技術(shù)第三頁，共九十頁，2022年，8月28日

核酸酶是通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致多核苷酸鏈共價(jià)鍵斷裂的一類水解酶，可分為核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)。按其水解斷裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶(exonuclease):從核酸末端順次水解磷酸二酯鍵核酸內(nèi)切酶(endonuclease)：內(nèi)部磷酸二酯鍵2.1限制性核酸內(nèi)切酶第四頁，共九十頁，2022年，8月28日寄主控制的限制(restriction)與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。λ噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其他宿主時會受到限制。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解。2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能第五頁，共九十頁，2022年，8月28日限制與修飾現(xiàn)象圖解Arber限制修飾酶第六頁，共九十頁，2022年，8月28日1968年，MeselsonandYuan從E.coli菌株Ｋ和Ｂ中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型限制酶；1970年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII。

第七頁，共九十頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。限制（Restriction）第八頁，共九十頁，2022年，8月28日細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶

CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基。修飾（Modification）第九頁，共九十頁，2022年，8月28日第十頁，共九十頁，2022年，8月28日2.1.2限制酶的分類與命名限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割DNA的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。第十一頁，共九十頁，2022年，8月28日三種類型限制酶的主要特性差異比較距識別序列下游24-26bp處識別序列內(nèi)或附近特異性切割距識別序列1kb處隨機(jī)性切割切割位點(diǎn)GAGCCCAGCAG旋轉(zhuǎn)對稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC識別序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）輔助因子異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白結(jié)構(gòu)雙功能單功能多功能限制修飾

Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性第十二頁，共九十頁，2022年，8月28日

I型酶屬復(fù)合功能酶，兼具限制、修飾兩種功能。核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4種活性。

顯著特點(diǎn)：識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致。酶分子首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌

B株和

K株分離的。

代表：EcoB和EcoK。I型限制性內(nèi)切酶第十三頁，共九十頁，2022年，8月28日識別位點(diǎn)序列EcoB：

TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修飾的特異序列。需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。作用機(jī)理第十四頁，共九十頁，2022年，8月28日在距離特異性識別位點(diǎn)約1000～1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb切割位點(diǎn)第十五頁，共九十頁，2022年，8月28日有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶作用。酶分子由兩個亞基組成。M亞基負(fù)責(zé)位點(diǎn)識別與修飾，R亞基具有核酸酶活性。在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、

Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸

）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACC

EcoP15:

CAGCAGⅢ類限制性內(nèi)切酶第十六頁，共九十頁，2022年，8月28日

1970年，由H.O.Smith和K.W.Wilcox（威爾科克斯）從流感嗜血菌中分離出來。分離的第一個酶是HindⅡ。

限制-修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩種不同酶分子組成，分子量小，能識別DNA的特殊序列，種類多，在基因工程中起重要作用。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶第十七頁，共九十頁，2022年，8月28日

能識別雙鏈DNA的特殊序列，并在這個序列內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。其種類繁多。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶即為此類。

在基因工程技術(shù)中，I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用。第十八頁，共九十頁，2022年，8月28日限制酶的命名1973年Smith和Nathans提出限制酶的命名原則，1980年Roberts對其系統(tǒng)化，如今簡化成：HindⅢ，來源菌株Haemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株H

in

d

Ⅲ微生物屬名種名株名(品系)發(fā)現(xiàn)序數(shù)第十九頁，共九十頁，2022年，8月28日識別雙鏈DNA分子中4～8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點(diǎn)2.1.3Ⅱ型限制酶的特性與DNA切割

(1)基本特性大多為回文序列第二十頁，共九十頁，2022年，8月28日5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI產(chǎn)生的5’粘性末端第二十一頁，共九十頁，2022年，8月28日5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstI產(chǎn)生的3’粘性末端第二十二頁，共九十頁，2022年，8月28日①連接便利

不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。粘性末端的意義第二十三頁，共九十頁，2022年，8月28日第二十四頁，共九十頁，2022年，8月28日③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。第二十五頁，共九十頁，2022年，8月28日5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等產(chǎn)生的平頭末端第二十六頁，共九十頁，2022年，8月28日常用的限制酶及其識別序列和切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割位點(diǎn)BamHⅠG↓GATCCPstⅠ

CTGCA↓G

ClaⅠAT↓CGATSalⅠG↓TCGACEcoRⅠG↓AATTC

Sau3AⅠ↓GATCHindⅢA↓AGCTTSfiⅠGGCCNNNN↓NGGCCHindⅡ

CTPy↓PuACSmaⅠCCC↓GGGKpnⅠGGTAC↓CXbaⅠT↓CTAGANotⅠGC↓GGCCGCXhoⅠC↓TCGAG第二十七頁，共九十頁，2022年，8月28日同裂酶（Isoschizomers)識別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’(2)同裂酶與同尾酶第二十八頁，共九十頁，2022年，8月28日XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和

SmaI。不完全同裂酶第二十九頁，共九十頁，2022年，8月28日識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、Xho

Ⅱ等。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。同尾酶(Isocaudamers）第三十頁，共九十頁，2022年，8月28日5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3AI同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’BamHIBgl

ⅡSau3AI5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBgl

Ⅱ第三十一頁，共九十頁，2022年，8月28日限制酶識別序列與DNA的來源無關(guān)，不具有種的特異性，對不同的DNA普遍適用。識別序列的長短涉及對DNA分子切割的頻率，可從理論上推導(dǎo)酶切DNA片段的大小。(3)Ⅱ型限制酶的識別序列與DNA的切割第三十二頁，共九十頁，2022年，8月28日限制酶識別序列的相鄰序列（長度要求）效應(yīng)。大多數(shù)限制酶對只含識別序列的寡核苷酸也不具催化活性的。限制酶的偏愛現(xiàn)象。限制酶對識別序列兩側(cè)的核苷酸的組成有關(guān)。（對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率）限制酶的星星活性。指某些限制酶在不適的環(huán)境中其識別序列發(fā)生改變（切割與識別序列相似的序列）的現(xiàn)象。第三十三頁，共九十頁，2022年，8月28日(1)底物DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。①加大酶的用量②加大反應(yīng)總體積（稀釋）③延長反應(yīng)時間2.1.4影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素當(dāng)DNA樣品確定后，為完全切割此DNA，酶的用量視酶的催化活性而定。酶活力單位：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1h，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)λDNA所需的酶量定為1U。第三十四頁，共九十頁，2022年，8月28日修飾體系組成部分，強(qiáng)烈影響酶的活性。大腸桿菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。E.coli的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。受其影響的酶有EcoRII等。(2)DNA樣品的甲基化程度第三十五頁，共九十頁，2022年，8月28日不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37℃，少數(shù)要求40℃～65℃。酶最適溫度℃酶最適溫度℃ApaIBclIMaeIITaqIApyI3050506530BstEIIMaeIIIBanIMaeISmaI6055504525(3)酶切消化反應(yīng)的溫度第三十六頁，共九十頁，2022年，8月28日緩沖液組分包括：氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、β-巰基乙醇或DTT（二巰基蘇糖醇）、BSA（牛血清白蛋白）、Tris-HCl等。高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些限制酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強(qiáng)的催化活性。(4)核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)第三十七頁，共九十頁，2022年，8月28日大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作0～50mM低鹽酶；100mM中鹽酶；150mM高鹽酶MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：

維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；試劑條件試劑條件Tris-HCl50mMpH7.5DTT1mMMgCl210mMVolume20-100μlNaCl0-150mMTt37℃1-1.5h第三十八頁，共九十頁，2022年，8月28日對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解；低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切；一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。Ⅱ

型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解第三十九頁，共九十頁，2022年，8月28日修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。DNA連接酶OHPnick5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPnick2.2DNA連接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’第四十頁，共九十頁，2022年，8月28日大腸桿菌DNA連接酶只能催化雙鏈DNA的互補(bǔ)黏性末端，以NAD+為能量。

T4噬菌體連接酶黏性、平末端均可連接，以ATP為能量。2.2.1基本性質(zhì)第四十一頁，共九十頁，2022年，8月28日2.2.2DNA連接酶的連接作用1）必須是兩條雙鏈DNA。2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團(tuán)（P）。3）需要能量

動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+(1)連接條件第四十二頁，共九十頁，2022年，8月28日第四十三頁，共九十頁，2022年，8月28日1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1h，完全連接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的酶量。試劑條件試劑條件Tris-HCl50～100mM,pH7.5DTT5mMMgCl210mMVolume10-20mlATP0.5-1mMTt4-15℃4-16h(2)DNA連接酶反應(yīng)條件第四十四頁，共九十頁，2022年，8月28日ATP（NAD+)提供激活的AMP。ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi(3)連接反應(yīng)過程“連接酶-AMP”復(fù)合物第四十五頁，共九十頁，2022年，8月28日AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMPDNA-腺苷酸”復(fù)合物第四十六頁，共九十頁，2022年，8月28日3’-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。第四十七頁，共九十頁，2022年，8月28日連接多個平頭雙鏈DNA分子：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶T4DNA連接酶第四十八頁，共九十頁，2022年，8月28日10～20倍。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。(1)插入片段與載體的濃度比例

(2)反應(yīng)溫度一般14~16℃。3.酶用量2.2.3影響連接反應(yīng)的因素第四十九頁，共九十頁，2022年，8月28日2.3DNA聚合酶常用的聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修飾過的T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化以DNA為模板合成DNA的一類酶。第五十頁，共九十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高常用DNA聚合酶的特性比較第五十一頁，共九十頁，2022年，8月28日共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’-OH端。主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。

T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)第五十二頁，共九十頁，2022年，8月28日基本性質(zhì)：5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-OH5’pppdNTPMg2+3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolⅠ2.3.1E.coliDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)第五十三頁，共九十頁，2022年，8月28日缺口前移標(biāo)記法5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’Nicktranslation制備32P標(biāo)記的探針DNaseⅠMg2+5’dNTP5’pppdA（a-32P-dATPDNApolⅠ基本用途第五十四頁，共九十頁，2022年，8月28日基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶；Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。2.3.2E.coliDNA聚合酶I大片段(Klenow)第五十五頁，共九十頁，2022年，8月28日基本用途補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列第五十六頁，共九十頁，2022年，8月28日補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第五十七頁，共九十頁，2022年，8月28日DNA片段的同位素末端標(biāo)記5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第五十八頁，共九十頁，2022年，8月28日3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA

限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25℃1h第五十九頁，共九十頁，2022年，8月28日mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物cDNA第二鏈的合成第六十頁，共九十頁，2022年，8月28日2.3.3T4-DNA聚合酶基本特性5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性；在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切；在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時停止；在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。第六十一頁，共九十頁，2022年，8月28日切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5’…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多。基本用途第六十二頁，共九十頁，2022年，8月28日DNA片段的同位素末端標(biāo)記5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’5’G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolMg2+5’pppdN5’pppdA（a-32P-dATP）T4-DNApol5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’第六十三頁，共九十頁，2022年，8月28日從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：增加大亞基對模板的親和性。2.3.4T7-DNA聚合酶第六十四頁，共九十頁，2022年，8月28日①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②

3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙。T7DNA聚合酶的特點(diǎn)第六十五頁，共九十頁，2022年，8月28日②進(jìn)行末端標(biāo)記①

以大分子量DNA為模板的合成如M13③補(bǔ)平隱蔽末端3’末端標(biāo)記。與T4DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。用途第六十六頁，共九十頁，2022年，8月28日T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修飾后的T7DNA聚合酶的用途①

DNA測序雙脫氧法。②標(biāo)記DNA3’隱蔽末端③更有效地補(bǔ)平末端修飾后的T7DNA聚合酶第六十七頁，共九十頁，2022年，8月28日基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA2.3.5反轉(zhuǎn)錄酶第六十八頁，共九十頁，2022年，8月28日雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’基本特性第六十九頁，共九十頁，2022年，8月28日2.4修飾酶類在基因克隆技術(shù)中，除了限制酶、連接酶、聚合酶這些主要的工具酶外，還經(jīng)常使用某些酶的相關(guān)功能對DNA或RNA進(jìn)行分子修飾，以使操作更加巧妙、簡便和高效。第七十頁，共九十頁，2022年，8月28日單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’2.4.1核酸酶第七十一頁，共九十頁，2022年，8月28日ExoVⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3’端外切雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）第七十二頁，共九十頁，2022年，8月28日lExoMg2+Ⅰ核酸外切酶特異性地從5’端外切3’5’3’5’雙鏈核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo)3’5’3’5’第七十三頁，共九十頁，2022年，8月28日S1核酸酶的基本特性單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0~4.3需要NaCl濃度10~300mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第七十四頁，共九十頁，2022年，8月28日內(nèi)切單鏈DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5’…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5’dNMPs或5’NMPs基本反應(yīng)第七十五頁，共九十頁，2022年，8月28日內(nèi)切帶切口或缺口的雙鏈DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5’nickgapS1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G3’…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5’基本反應(yīng)第七十六頁，共九十頁，2022年，8月28日在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI重要用途第七十七頁，共九十頁，2022年，8月28日基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5’dNMPs或5’NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶第七十八頁，共九十頁，2022年，8月28日誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化ACBal31核酸酶的基本用途第七十九頁，共九十頁，2