植物組織培養(yǎng)技術(shù)二

專題3植物組織培養(yǎng)技術(shù)思考1、原理:2、必要條件：植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞離體一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官植物組織培養(yǎng)技術(shù)3、細(xì)胞的全能性①定義：生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能的特性②原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因已分化的植物細(xì)胞，仍具有全能性③實(shí)例受精卵>生殖細(xì)胞>體細(xì)胞④全能性的比較:1）、培育無病毒植株2）、培養(yǎng)紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）4)、基因工程中亦需到植物組織培養(yǎng)的方法4、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：3）、誘導(dǎo)離體的植物組織形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀結(jié)構(gòu)，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題課題目標(biāo)說明植物組織培養(yǎng)的基本原理，學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)，進(jìn)行菊花或其他植物的組織培養(yǎng)。課題重點(diǎn)與難點(diǎn)課題重點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)過程中使用的無菌技術(shù)。課題難點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)過程中使用的無菌技術(shù)。課題1：菊花的組織培養(yǎng)一、基礎(chǔ)知識1、植物的組織培養(yǎng)（1）細(xì)胞的分化①概念：在個(gè)體發(fā)育中，相同細(xì)胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程②過程：如：受精卵增殖、生長、分化形成組織、器官、系統(tǒng)③特點(diǎn)：（2）穩(wěn)定性：細(xì)胞分化是穩(wěn)定的，一般是不可逆轉(zhuǎn)的（3）全能性：已分化的細(xì)胞，仍具有發(fā)育的潛能（1）持久性：是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個(gè)生命過程中,在胚胎期達(dá)到最大限度⑤原因：基因在特定的時(shí)間和空間條件下的選擇性表達(dá)的結(jié)果④結(jié)果：形成不同的細(xì)胞和組織2、植物組織培養(yǎng)過程:離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)脫分化：指已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞,當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體(也受到創(chuàng)傷)培養(yǎng)時(shí),已停止分裂的細(xì)胞,又重新恢復(fù)分裂,細(xì)胞改變原有的分化狀態(tài),失去原有結(jié)構(gòu)和功能,成為具有未分化特性的細(xì)胞。再分化：已經(jīng)脫分化的細(xì)胞在一定條件下,又可經(jīng)過愈傷組織或胚狀體,再分化出根和芽,形成完整植株,這一過程叫作再分化。愈傷組織:細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則,是高度液泡化的、成無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞菠蘿的愈傷組組織愈傷組織2、影響植物物組織培養(yǎng)的的因素（1）植物材材料的選擇煙草和胡蘿卜卜的組織培養(yǎng)養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織織的芽誘導(dǎo)比比較難同一植物材料料的年齡、保保存時(shí)間的長長短會影響實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果菊花的組織培培養(yǎng)一般選擇擇未開花植株株的莖上部新新萌生的側(cè)枝枝一般來說，容容易進(jìn)行無性性繁殖的植物物，也容易進(jìn)進(jìn)行組織培養(yǎng)養(yǎng)，如蘆薈、、豆瓣綠、秋秋海棠、月季季（2）不同的的離體組織和和細(xì)胞對營養(yǎng)養(yǎng)、環(huán)境等條條件的要求相相對特殊，需需配置不同的的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基主主要成分包括括：A、大量元素素:N、P、K、Ca、Mg、S等B、微量元素素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、、Mo、I、、Co等C、有機(jī)物:如氨基酸、、煙酸、肌醇醇、維生素，，蔗糖等D、植物激素素①常用的植物激激素：生長素素、細(xì)胞分裂裂素和赤霉素（3）植物激激素的影響使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先使用生長素，后使用細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞分裂，但不利分化先使用細(xì)胞分裂素后使用生長素細(xì)胞即分裂也分化同時(shí)使用分化頻率高②生長素和細(xì)胞胞分裂素作用用生長素細(xì)胞分裂素：>有利于根的分分化生長素細(xì)胞分裂素：<有利于芽的分分化，抑制根根的分化生長素細(xì)胞分裂素：＝促進(jìn)愈傷組織織生長③生長素和細(xì)胞胞分裂素同時(shí)時(shí)使用，用量量的比例對植植物細(xì)胞發(fā)育育方向的影響響（4）pH、、溫度、光照照pH控制在5.8左右，，溫度控制在在18－22。C,每日用日日光燈照射12h生長素細(xì)胞分裂素：<討論：你能說說出各種營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)的作用用嗎？同專題題2中微生物物培養(yǎng)基的配配方相比，MS培養(yǎng)基的的配方有哪些些明顯的不同同？答：微量元素和大大量元素提供供植物細(xì)胞生生活所必需的的無機(jī)鹽；蔗蔗糖提供碳源源，同時(shí)能夠夠維持細(xì)胞的的滲透壓；甘甘氨酸、維生生素等物質(zhì)主主要是為了滿滿足離體植物物細(xì)胞在正常常代謝途徑受受到一定影響響后所產(chǎn)生的的特殊營養(yǎng)需需求。微生物培養(yǎng)基基以有機(jī)營養(yǎng)養(yǎng)為主。與微微生物的培養(yǎng)養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需需提供大量無無機(jī)營養(yǎng)，無無機(jī)鹽混合物物包括植物生生長必須的大大量元素和微微量元素兩大大類。植物組織培養(yǎng)養(yǎng)過程離體的植物器器官、組織、、細(xì)胞脫分化愈傷組織再分化芽根植物體組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)過程簡圖移栽制備MS固體體培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)養(yǎng)栽培培二、實(shí)驗(yàn)操作作移栽栽MS培養(yǎng)基的的配制操作步步驟（1）MS培培養(yǎng)基母液的的配制:MS培養(yǎng)基含含有十幾種化化合物，配制制不方便也難難稱量準(zhǔn)確，，可將培養(yǎng)基基中的各種成成分?jǐn)U大一定定倍數(shù)分別稱稱量，配成濃濃縮液，這種種濃縮液叫做做培養(yǎng)基母液液。(母液配配制見下表)（2）MS（1000mL）培養(yǎng)養(yǎng)基的配制:按比例分別取取適量各種成成分的母液，，加入燒杯，，稱取蔗糖30g，瓊脂脂7g，加水水并加熱使瓊瓊脂溶解，按按照需要的濃濃度分別加入入激素，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)節(jié)pH至5.8~6.0。將配好的的培養(yǎng)基迅速速分裝至組培培瓶中，擰上上蓋子，放入入滅菌鍋121℃，滅菌菌20min。③培養(yǎng)基的分分裝注：由于菊花花的莖段的組組織培養(yǎng)比較較容易，因此此不必添加植物物激素3、滅菌分裝好的培養(yǎng)養(yǎng)基連同其他他器械一起進(jìn)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌菌植物組培具體體操作步驟（1）取材：：取菊花生長旺旺盛的嫩枝(外植體不能能太小，否則則會影響愈傷傷組織的形成成)。（2）消毒與與修剪外植體體：①流水沖洗后后,加少許洗洗衣粉刷洗,流水沖20分鐘;②放入70﹪﹪酒精中搖動動2~3次,持續(xù)6~7秒,無菌水水沖洗2~3次，用無菌菌吸水紙吸干干;③放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)為0.1%氯化汞溶液液中浸泡1～～2分鐘,無菌水沖洗洗2~3次，，無菌吸水紙紙吸干。（3）接種常用滅菌劑使使用濃度及效效果比較表植物組織培養(yǎng)養(yǎng)消毒與接種種示意圖接種注意事項(xiàng)項(xiàng)①每接種一塊塊外植體前，，鑷子需放入入體積分?jǐn)?shù)為為75％的酒酒精溶液中消消毒一次，然然后在酒精燈燈火焰上燒一一遍，冷卻后后再接種②外植體在培培養(yǎng)基中要分分布均勻，放放置外植體數(shù)數(shù)量根據(jù)錐形形瓶的大小確確定，一般胡胡蘿卜3－4塊，菊的莖莖或葉6－8塊，也不要要太少，以充充分利用培養(yǎng)養(yǎng)基中的營養(yǎng)養(yǎng)成分和光照照條件③插入時(shí)應(yīng)注注意方向，不不要倒插。莖莖段、莖尖基基部插入培養(yǎng)養(yǎng)基利于吸收收水分和養(yǎng)分分思考：你打算算做幾組重復(fù)復(fù)？你打算設(shè)設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)嗎？答：每每種材材料或或配方方至少少要做做一組組以上上的重重復(fù)。。設(shè)置置對照照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)可以以取用用一個(gè)個(gè)經(jīng)過過滅菌菌的裝裝有培培養(yǎng)基基的錐錐形瓶瓶，與與接種種操作作后的的錐形形瓶一一同培培養(yǎng)，，用以以說明明培養(yǎng)養(yǎng)基制制作合合格，，沒有有被雜雜菌污污染。。（4））培養(yǎng)養(yǎng)1、愈愈傷組組織的的培養(yǎng)養(yǎng)從接種種外植植體到到出現(xiàn)現(xiàn)愈傷傷組織織需經(jīng)經(jīng)過2周時(shí)時(shí)間。。2周周之內(nèi)內(nèi)可以以看到到外植植體上上逐漸漸長出出乳白白色或或黃白白色的的瘤狀狀愈傷傷組織織。首次培培養(yǎng)愈愈傷組組織時(shí)時(shí)，見見不見見光因因不同同植物物而異異，菊菊花在在見光光條件件下愈愈傷組組織長長的更更快。。胡蘿蘿卜無無光才才長得得好。。2周后后，培培養(yǎng)基基成分分接近近耗盡盡，必必須更更換培培養(yǎng)基基，進(jìn)進(jìn)行繼繼代培培養(yǎng)，，約20d2、試試管苗苗的培培養(yǎng)當(dāng)愈傷傷組織織長到到一定定大小小后，，可以以更換換培養(yǎng)養(yǎng)基，，進(jìn)行行試管管苗培養(yǎng)（五））移栽栽1、打打開封封口膜膜2、清清洗轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移（六））栽培培3、移移栽材料的的移栽栽及溫溫室培培養(yǎng)：：煉苗：：先在在外界界環(huán)境境閉瓶瓶鍛煉煉3天天，再再開瓶瓶鍛煉煉3天天（以以培養(yǎng)養(yǎng)基上上開始始長出出菌為為宜））。移栽：：去凈凈培養(yǎng)養(yǎng)基，，可先先在滅滅過菌菌的珍珍珠巖巖或蛭蛭石上上培養(yǎng)養(yǎng)使根根系發(fā)發(fā)達(dá)再再轉(zhuǎn)移移到土土壤中中。菊花煉煉苗菊花移移栽苗苗1、外外植體體帶菌菌2、培培養(yǎng)基基及接接種器器具滅滅菌不不徹底底3、接接種操操作時(shí)時(shí)帶入入4、環(huán)環(huán)境不不清潔潔植物組組培污污染途途徑污染的的預(yù)防防措施施（一））防止止外植植體帶帶菌（二））保證證培養(yǎng)養(yǎng)基及及接種種器具具徹底底滅菌菌（三））操作作人員員嚴(yán)格格遵守守?zé)o菌菌操作作規(guī)程程（四））保證證接種種與培培養(yǎng)環(huán)環(huán)境清清潔1、培培養(yǎng)基基的滅滅菌（（高壓壓蒸汽汽滅菌菌）2、外外植體體的消消毒（（酒精精、氯氯化汞汞）3、接接種的的無菌菌操作作（酒酒精、、酒精精燈———灼灼燒））4、無無菌箱箱中的的培養(yǎng)養(yǎng)；5、移移栽到到消過過毒的的環(huán)境境中生生存一一段時(shí)時(shí)間。。思考：：在整整個(gè)操操作過過程中中，是是如何何來實(shí)實(shí)現(xiàn)無無菌環(huán)環(huán)境的？？組織培培養(yǎng)原理過程意義利用植植物細(xì)細(xì)胞的的全能能性快速繁繁殖，，培育育無毒毒植株株，培培育作作物新新品種種根芽植物體體離體植物器官、組織或細(xì)胞(脫分化)愈傷組織(再分化)植物組組織培培養(yǎng)小小結(jié):操作條條件含有全全部營營養(yǎng)成成分的的培養(yǎng)養(yǎng)基、、一定定的溫溫度、、空氣氣、無無菌環(huán)環(huán)境、、適合合的PH、、適時(shí)時(shí)光照照等練習(xí)1.答答：植植物組組織培培養(yǎng)所所利用用的植植物材材料體體積小小、抗抗性差差，對對培養(yǎng)養(yǎng)條件件的要要求較較高。。用于于植物物組織織培養(yǎng)養(yǎng)的培培養(yǎng)基基同樣樣適合合于某某些微微生物物的生生長，，如一一些細(xì)細(xì)菌、、真菌菌等的的生長長。而而培養(yǎng)養(yǎng)物一一旦受受到微微生物物的污污染，，就會會導(dǎo)致致實(shí)驗(yàn)驗(yàn)前功功盡棄棄，因因此要要進(jìn)行行嚴(yán)格格的無無菌操操作。。2.答答：外外植體體的生生理狀狀態(tài)是是成功功進(jìn)行行組織織培養(yǎng)養(yǎng)的重重要條條件之之一。。生長長旺盛盛的嫩嫩枝生生理狀狀況好好，容容易誘誘導(dǎo)脫脫分化化和再再分化化。影響植植物組組織培培養(yǎng)的的影響響因素素及及注意意事項(xiàng)項(xiàng)影響植植物組組織培培養(yǎng)的的幾個(gè)個(gè)因素素植物的的材料料培養(yǎng)基基植物激激素pH值值外界因因素（（溫度度，光光照，，通氣氣狀況況，材材料處處理等等）【注意意事項(xiàng)項(xiàng)】1、實(shí)實(shí)驗(yàn)所所使用用的器器材必必須要要嚴(yán)格格滅菌菌，注注意無無菌操操作，，避免免因染染菌導(dǎo)導(dǎo)致實(shí)實(shí)驗(yàn)失失??；；2、配配制貯貯存母母液時(shí)時(shí)，要要算好好各種種成分分逐次次加入入，等等第一一種成成分完完全溶溶解后后再加加入第第二種種成分分，切切忌““一鍋鍋煮””。有有機(jī)物物質(zhì)和和鐵鹽鹽溶液液配好好以后后要裝裝入棕棕色瓶瓶放入入電冰冰箱內(nèi)內(nèi)保存存，其其它兩兩種種種母液液可在在常溫溫下保保存但但最多多不能能超過過一個(gè)個(gè)月；；3、pH值值對培培養(yǎng)基基的硬硬度有有影響響，pH過過高培培養(yǎng)基基變硬硬，pH過過低培培養(yǎng)基基不能能凝固固，所所以要要調(diào)整整好培培養(yǎng)基基的pH值值；4、材材料脫脫毒時(shí)時(shí)不要要在酒酒精中中停留留過長長時(shí)間間，以以免材材料被被殺死死。5、所所有制制備好好的溶溶液和和試劑劑瓶上上都要要有標(biāo)標(biāo)簽，，注上上名稱稱、濃濃度、、消毒毒與否否和制制備日日期。。組織培培養(yǎng)實(shí)實(shí)驗(yàn)室室設(shè)置置及設(shè)設(shè)備介介紹（1））實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室設(shè)設(shè)置組織培培養(yǎng)實(shí)實(shí)驗(yàn)室室設(shè)置置簡圖圖（2））組組培相相關(guān)設(shè)設(shè)備儀儀器介介紹電子天天平純純水水機(jī)酸度計(jì)計(jì)高高壓滅滅菌鍋鍋干燥箱箱搖搖床超凈工工作臺臺數(shù)數(shù)碼碼顯微微鏡數(shù)碼顯顯微鏡鏡又叫叫視頻頻顯微微鏡，，它是是將顯顯微鏡鏡看到到的實(shí)實(shí)物圖圖像通通過數(shù)數(shù)模轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換，，使其其成像像在顯顯微鏡鏡自帶帶的屏屏幕上上或計(jì)計(jì)算機(jī)機(jī)上。。我我們可可以對對微觀觀領(lǐng)域域的研研究從從傳統(tǒng)統(tǒng)的普普通的的雙眼眼觀察察到通通過顯顯示器器上再再現(xiàn)，，從而而提高高了工工作效效率。。培養(yǎng)養(yǎng)架架恒恒溫溫光光照照培培養(yǎng)養(yǎng)箱箱非洲洲菊菊雛菊菊金盞盞菊菊波斯斯菊菊百日日草草孔雀雀草草9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。20:01:2020:01:2020:011/1/20238:01:20PM11、以以我我獨(dú)獨(dú)沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。1月-2320:01:2020:01Jan-2301-Jan-2312、故人江海海別，幾度度隔山川。。。20:01:2020:01:2020:01Sunday,January1,202313、乍見翻疑夢夢，相悲各問問年。。1月-231月-2320:01:2120:01:21January1,202314、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。01一一月月20238:01:21下下午午20:01:211月月-2315、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。。一月238:01下下午午1月-2320:01January1,202316、行動出成成果，工作作出財(cái)富。。。2023/1/120:01:2120:01:2101January202317、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時(shí)時(shí)，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點(diǎn)的的射線向前前。。8:01:21下下午午8:01下下午午20:01:211月月-239、沒有失失敗，只只有暫時(shí)時(shí)停止成成功！。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事事情努力力了未必必有結(jié)果果，但是是不努力力卻什么么改變也也沒有。。。20:01:2120:01:2120:011/1/20238:01:21PM11、成功就是日日復(fù)一日那一一點(diǎn)點(diǎn)小小努努力的積累。。。1月-2320:01:2120:01Jan-2301-Jan-2312、世間成事，，不求其絕對對圓滿，留一一份不足，可可得無限完美美。。20:01:2120:01:2120:01Sunday,January1,202313、不知知香積積寺，，數(shù)里里入云云峰。。。1月-231月-2320:01:2120:01:21January1,202314、意志堅(jiān)堅(jiān)強(qiáng)的人人能把世世界放在在手中像像泥塊一一樣任意意揉捏。。01一一月20238:01:21下午午20:01:211月-2315、楚塞三湘接接，荊門九派派通。。。一月238:01下下午1月-2320:01January1,202316、少年年十五五二十十時(shí)，，步行行奪得得胡馬馬騎。。。2023/1/120:01:2120:01:2101January202317、空空山山新新雨雨后后，，天天氣氣晚晚來來秋秋。。。。8:01:21下下