食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)一食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定(凱氏定氮法)一、目的與要求1、學(xué)習(xí)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理。2、掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質(zhì)含量計(jì)算等。二、實(shí)驗(yàn)原理1、消解：蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸在催化劑作用下共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨而留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。NH(CH2)COOH+13HSO=(NH)SO+6CO+12SO+16HO224424222濃硫酸將有機(jī)物炭化后為碳、氫與氮，將形成的碳氧化：2HSO+C(A)=CO+2H0+2S0f24222生成的二氧化硫?qū)⒀趸瘧B(tài)的氮還原為氨而自身被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，HSO+2NH=(NH)SO243424在消解試驗(yàn)中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消解時(shí)間，常常加入下列物質(zhì)：硫酸鉀：一般濃硫酸的沸點(diǎn)為40°C，但加入硫酸鉀后，硫酸不斷分解，水不斷溢出引起硫酸鉀濃度不斷增加，沸點(diǎn)因此而增加。KSO+HSO=KHSOTOC\o"1-5"\h\z2 4 2 4 4KHSO(A)=KSO+HOf+SO4 2 4 2 3但硫酸鉀濃度不能太大，否則消化溫度過高會(huì)引起銨鹽的熱分解而釋放出氨，(NH)SO(A)=(NH)SO+NHf4 2 4 4 2 4 32KSO(A)=2HO+2NHf+2SOf4 2 3 3除了可以添加硫酸鉀之外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等以提高溶液溫度，但效果要差于硫酸鉀。硫酸銅：硫酸銅可以催化反應(yīng)。可以采用的催化劑除了硫酸銅外，還可以加入氧化汞、汞、硒粉以及二氧化鈦等，但考慮效果、價(jià)格以及污染等原因外，最常用的還是硫酸銅，同時(shí)可以加入少量的過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物的氧化，反應(yīng)機(jī)理為：2CuSO(A)=CuSO+Of+SOfTOC\o"1-5"\h\z4 2 4 2 2C+CuSO(A)=CuSO+COf+SOf4 2 4 2 2HSO+CuSO(A)=2CuSO+2HOf+SOf2 4 2 4 4 2 2此反應(yīng)不斷進(jìn)行，如溶液沒有褐色生成(CuS0顏色)而呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色，說明有機(jī)24物已經(jīng)全部被消解完畢。因此，在試驗(yàn)過程中，硫酸銅不但能夠催化反應(yīng)，而且能夠指示反應(yīng)的進(jìn)行程度。2、堿化蒸餾：在消解完全的樣品溶液中加入過量的濃的氫氧化鈉溶液使溶液呈現(xiàn)堿性，加熱蒸餾而放出氨氣：2NaOH+(NH)SO(A)=NaSO+2H0+2NHfTOC\o"1-5"\h\z4 2 4 2 4 2 33、吸收與滴定：將加熱蒸餾釋放出來的氨利用硼酸溶液進(jìn)行吸收，因硼酸屬于弱酸，其后再用鹽酸進(jìn)行滴定：2NH+HB0=(NH)B0+5H043 3 4247 2(NH)B0+5H0+2HCl=2NHC1+4HBO247 2 4 3 3除此之外，也可以用過量的鹽酸或者硫酸吸收整流而出的氨氣，然后再用氫氧化鈉進(jìn)行回滴。三、儀器與試劑試劑1、 硫酸銅(CuSO4?5H20)2、 硫酸鉀3、 濃硫酸(密度為1.84g/ml)4、 硼酸溶液(20g/L)5、 氫氧化鈉溶液(400g/L)6、 0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。7、 混合指示試劑：0.1%甲基紅乙醇溶液液：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液=1:5。儀器微量定氮蒸餾裝置：凱氏燒瓶，如圖所示。拾U：則L氏走矩I <h.醫(yī)T肉轉(zhuǎn)皆木丿山n倚2一一水M匕頭 鼻箕的十二雄借 1—第L氏雄用禮云r7 珂片抑S卑飾煉片血 9 縱丸紫IOjLti+'PSri<1冷;心拯畋舷四、實(shí)驗(yàn)步驟1、樣品消化稱取固體樣品0.2-2.0g（半固體2-5g，液體樣品10-20ml），移入潔凈干燥的500mL凱氏燒瓶中，加入0.5g硫酸銅、5g硫酸鉀與1Oml濃硫酸，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，使用電爐，在通風(fēng)櫥中（不能瓶口對(duì)人）小火慢慢加熱消化，開始時(shí)用低溫加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5h，取下放冷。2、 蒸餾與吸收將凱氏定氮儀按圖示連接，凱氏瓶中加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防暴沸，小心加10mL水，放冷后再加入70ml的NaOH溶液，在吸收瓶中加入30ml的硼酸吸收液并加入2-3滴混合指示劑，開始加熱，打開冷凝水，設(shè)置蒸餾時(shí)間為10s。將冷凝管下端提離液面，并用蒸餾水沖洗管口。3、 將上述吸收液用0.1000mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，溶液由藍(lán)色變?yōu)槲⒓t即為終點(diǎn)，記錄鹽酸用量。做空白試驗(yàn)，記錄相應(yīng)消耗的鹽酸體積。五、結(jié)果計(jì)算（V-V）CMX（%）=1 2 XFX100%1000m式中X――樣品蛋白質(zhì)百分含量（%）；V1——樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；V2——空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度（mol/L）F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，0.1055mol/LM為氮的摩爾質(zhì)量，14.0g/mol計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。六、注意事項(xiàng)及說明1、 消化時(shí)，若樣品含糖高或含脂及較多時(shí)，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失?？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。2、 消化開始時(shí)，不能用強(qiáng)火，應(yīng)該慢慢加熱，防止暴沸或樣品粘附于瓶壁而消解不完全。為此，消化時(shí)應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對(duì)樣品徹底消化。3、 若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。4、 蒸餾裝置不能漏氣，蒸餾完畢后，應(yīng)將冷凝管下端提離液面并清洗管口，繼續(xù)蒸餾一分鐘后再停止加熱，否則可能造成倒吸。5、 硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否則氨吸收減弱，造成檢測(cè)結(jié)果偏低