華中農(nóng)業(yè)大學病毒學實驗技術第六章病毒純化

一、病毒純化的標準保持感染性具有均一性：結晶形成檢測病毒制備物均一性的方法：電鏡觀察：大小、形態(tài)均一超速離心：沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶電泳：顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶免疫學方法：只與特異性抗體發(fā)生反應大小、形態(tài)、密度、化學組成、分子量、抗原性第一頁，共三十一頁。二、病毒純化的理論依據(jù)病毒體外表面的主要化學組成是蛋白質(zhì)，可利用蛋白質(zhì)提純的方法純化病毒病毒體具有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術提純病毒第二頁，共三十一頁。三、病毒純化前的預處理1、病毒感染的組織、臟器或細胞研磨勻漿超聲波處理反復凍融低速離心去掉細胞碎片2、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液低速離心去掉可能含有的雜質(zhì)或直接用于病毒的分離純化第三頁，共三十一頁。沉淀法超速離心法超濾法層析法兩相溶劑間分配系數(shù)法吸附法電泳法四、病毒純化的方法第四頁，共三十一頁。（一）沉淀法主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。中性鹽沉淀法（鹽析）聚乙二醇沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法皂土法魚精蛋白沉淀法第五頁，共三十一頁。1、中性鹽沉淀法（鹽析）先用其它方法去除材料中的大量雜質(zhì)，再以高濃度的中性鹽溶液鹽析，析出的沉淀用緩沖液懸浮后再進行鹽析，反復幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。第六頁，共三十一頁。2、聚乙二醇（PEG）沉淀法用于病毒沉淀的分子量：2000-6000將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其達到所需濃度，在4℃攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。第七頁，共三十一頁。3、有機溶劑沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液的介電常數(shù)，從而增加病毒顆粒表面不同電荷之間的引力，導致其溶解度降低。B、與水作用，破壞蛋白質(zhì)分子的水化膜。優(yōu)點：分辨力高，易除去缺點：易使表面蛋白質(zhì)變性，溶解脂質(zhì)第八頁，共三十一頁。4、等電點沉淀法（分辨力不高）原理：病毒粒子在等電點時，所攜帶的正電荷與負電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。多數(shù)病毒的等電點在pH4.０~5.5之間。第九頁，共三十一頁。5、皂土法輪狀病毒皂土在酸性條件下（pH4~4.5)可吸附輪狀病毒，在堿性條件下(pH8.5)，又使其洗脫下來。第十頁，共三十一頁。6、魚精蛋白沉淀法（沉淀直徑大于50nm的病毒）魚精蛋白為堿性蛋白，具有攜帶其它蛋白質(zhì)（直徑大于50nm）共沉淀的作用，當向這種沉淀物加入1mol/LNaCl時，其它蛋白質(zhì)又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白仍然沉淀。第十一頁，共三十一頁。（二）層析法葡聚糖柱層析法凝膠層析法離子交換柱層析法親和層析法第十二頁，共三十一頁。（三）兩相溶劑間分配系數(shù)法原理：溶質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而選擇性地分配于其中的一方。常用的溶劑：葡聚糖硫酸鹽（dextransulphate,Ds)聚乙二醇（PEG）甲基纖維素（MC）聚乙烯醇（PVA）分配體系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系第十三頁，共三十一頁。（四）吸附法原理：利用對病毒或對雜質(zhì)有選擇吸附能力的固體吸附劑吸附病毒或吸附雜質(zhì)，再用一定的鹽溶液把它們洗脫下來。

作為吸附劑必須具備的特點：有較大的表面積和吸附能力較高的吸附選擇性便于洗脫性質(zhì)穩(wěn)定第十四頁，共三十一頁。常用吸附劑：白土磷酸鈣硅藻土紅細胞離子交換樹脂羧甲基纖維素第十五頁，共三十一頁。（六）超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。優(yōu)點：可用于大容量樣品的濃縮可以在室溫或低溫下操作對被濃縮產(chǎn)物的損害小濃縮的同時可達到部分純化回收率高可防止外來污染（五）電泳法第十六頁，共三十一頁。（七）離心法差速離心速度區(qū)帶離心法密度梯度離心第十七頁，共三十一頁。1.差速離心法原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。用途：從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附釋放的病毒懸液中提純病毒。優(yōu)點：可快速處理大量樣品步驟：低速（2000-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質(zhì)。再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。第十八頁，共三十一頁。速度梯度離心法密度梯度離心法原理沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度的不同進行分離沉降與顆粒密度成正比，以物質(zhì)浮密度的不同進行分離介質(zhì)密度小，1-1.3286，預制梯度，不連續(xù)密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度離心力場強，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降稍強，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴散平衡離心過程樣品向離心管底沉降樣品停留于介質(zhì)的等密度部位離心時間較短，幾小時到幾十小時較長，十幾小時到數(shù)天2.速度梯度離心法與密度梯度離心法第十九頁，共三十一頁。速度梯度離心密度梯度離心…………AB第二十頁，共三十一頁。五、病毒純化應注意的問題1、保持病毒的感染性嚴格控制溫度、pH及試劑的選擇。2、選用適宜的純化實驗起始材料無其它病毒或毒株的污染病毒體的含量高雜質(zhì)含量少并易于處理第二十一頁，共三十一頁。3、根據(jù)具體情況選擇提純方法根據(jù)需要純化的病毒的性質(zhì)、起始材料的特點、研究的目的以及實驗室的條件等，選擇適宜的純化方法。4、建立靈敏的病毒鑒定和測定方法第二十二頁，共三十一頁。六、偽狂犬病毒的濃縮提純1、病毒材料將偽狂犬病病毒接種于PK-15細胞，病變后收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，即為樣品材料。第二十三頁，共三十一頁。2．病毒提純濃縮去細胞碎片及雜質(zhì)：將細胞培養(yǎng)物4℃3000r/min離心30min，收集上清液。硫酸銨沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸銨的量加入硫酸銨，攪勻后置4℃冰箱攪拌沉淀過夜，4℃5000r/min離心40min，去上清，沉淀用適量的滅菌ddH2O懸浮。透析：將懸浮的病毒液裝于透析袋中，于ddH2O或PBS中攪拌透析，每半個小時換一次液，共換5次，第5次透析過夜。第二十四頁，共三十一頁。濃縮：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至合適的體積。超離純化：在離心管中加入不同濃度的甘油墊層，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。加入病毒懸液（應不超過離心管總容積的10%）。20000-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸（渦旋或超聲波處理，使沉淀分散）。速度區(qū)帶離心第二十五頁，共三十一頁。密度梯度離心在離心管中加入不同濃度的CsCl或蔗糖墊層，再加入病毒懸液，超高速離心。蔗糖密度梯度離心：在離心管中加入20%～60%不連續(xù)蔗糖密度梯度,20000-25000r/min離心2h～3h，收集蔗糖濃度為35%處的病毒帶，加入適量緩沖液稀釋后，再次20000-25000r/min離心2h，沉淀用適量TEN重懸。

PrV鄂A株電鏡觀察左圖：上帶中的PrV粒子右圖：下帶中的PrV粒子第二十六頁，共三十一頁。濃縮（方法二）將經(jīng)低速離心去掉細胞碎片及雜質(zhì)的病毒懸液直接20000-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸。將重懸的病毒液再經(jīng)梯度離心純化。第二十七頁，共三十一頁。如何利用純化的病毒進行下一步的研究研究病毒的結構研究病毒感染的分子細節(jié)病毒粒子的標記研究與受體的結合研究病毒的侵入研究病毒在體內(nèi)的移行第二十八頁，共三十一頁。病毒純化質(zhì)譜分析靶蛋白驗證純化的病毒是不是只含有病毒的蛋白？第二十九頁，共三十一頁。P