十三細(xì)胞凋亡與衰老

●細(xì)胞凋亡(Apoptosis)

●細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)第十三章細(xì)胞凋亡與衰老第一頁(yè)，共五十頁(yè)。第一節(jié)細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理第二頁(yè)，共五十頁(yè)。一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●概念：細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程，由于細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的遺傳機(jī)制決定的程序性控制，所以也常常被稱(chēng)為細(xì)胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。

●生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。

細(xì)胞凋亡的失調(diào)可導(dǎo)致多種疾?。旱蛲霾蛔銜?huì)導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾??；凋亡過(guò)度會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的喪失或免疫低下。

第三頁(yè)，共五十頁(yè)。

(1)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.

通過(guò)細(xì)胞凋亡可以清除機(jī)體不再需要的細(xì)胞而不引起炎癥反應(yīng)。(2)確保正常的生長(zhǎng)發(fā)育

蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡

脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，

發(fā)育過(guò)程中手和足的成形過(guò)程。

(3)積極參與機(jī)體防御如:病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞通過(guò)DNA片段化阻止病毒

DNA復(fù)制。第四頁(yè)，共五十頁(yè)。第五頁(yè)，共五十頁(yè)。第六頁(yè)，共五十頁(yè)。第七頁(yè)，共五十頁(yè)。二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的生化特征●誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子●細(xì)胞凋亡的檢測(cè)●細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)第八頁(yè)，共五十頁(yè)。1.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線(xiàn)粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線(xiàn)粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)的凋亡小體

◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化第九頁(yè)，共五十頁(yè)。

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)第十頁(yè)，共五十頁(yè)。第十一頁(yè)，共五十頁(yè)。2.細(xì)胞凋亡的生化特征◆細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為

180～200bp特征性的DNAladders ◆凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）積累并達(dá) 到較高水平第十二頁(yè)，共五十頁(yè)。3.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線(xiàn)（紫外線(xiàn)，射線(xiàn)等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA

和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等第十三頁(yè)，共五十頁(yè)。4.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)◆形態(tài)學(xué)觀測(cè)：染色法：臺(tái)盼蘭:使死細(xì)胞染色中性紅:活細(xì)胞染色

DAPI:可觀察到細(xì)胞核的形態(tài)變化

Giemsa:可觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊，凋亡小體的形成透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測(cè)定法：指末端脫氧核苷酸移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法。通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果。第十四頁(yè)，共五十頁(yè)?！翦缧请娪痉ǎ╟ometassay）將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場(chǎng)中進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段．在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無(wú)DNA斷裂的核在泳動(dòng)時(shí)保持圓球形，這是一種快速簡(jiǎn)便的凋亡檢測(cè)法。◆流式細(xì)胞分析

根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。

第十五頁(yè)，共五十頁(yè)。5.細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)●二者的主要區(qū)別是：細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptoticbodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會(huì)逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。相反，在細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏。細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)?？赡苁羌?xì)胞程序性死亡的另一種形式?！窦?xì)胞自噬：是與細(xì)胞凋亡不同的另一種程序性死亡。第十六頁(yè)，共五十頁(yè)。壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞第十七頁(yè)，共五十頁(yè)。細(xì)胞變圓,與周?chē)?xì)胞脫開(kāi)細(xì)胞外形不規(guī)則變化核染色質(zhì)凝聚溶酶體破壞細(xì)胞膜反折細(xì)胞膜破裂細(xì)胞分為一個(gè)個(gè)小體胞漿外溢被周?chē)?xì)胞吞噬，無(wú)炎癥反應(yīng)；引起周?chē)装Y反應(yīng)

細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死

ApoptosisNecrosis第十八頁(yè)，共五十頁(yè)。三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理●線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類(lèi)同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡 ●Bcl-2家族、線(xiàn)粒體與細(xì)胞凋亡

●p53與細(xì)胞凋亡●細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)第十九頁(yè)，共五十頁(yè)。1.Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱(chēng)為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆Caspase活化途徑◆胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑第二十頁(yè)，共五十頁(yè)。caspase超家族成員及其相應(yīng)底物第二十一頁(yè)，共五十頁(yè)。Caspase活化caspase的活化則需在兩個(gè)亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割，結(jié)果產(chǎn)生了由兩個(gè)亞基組成的異二聚體，此即具有活性的酶。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的起始者(Caspase2，8，9，10，11)和執(zhí)行者(Caspase3，6和7)之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者。細(xì)胞凋亡活化因子：Apaf1、Apaf2、Apaf3。第二十二頁(yè)，共五十頁(yè)。ThecaspasecascadeinvolvedinapoptosisProcaspaseactivationbyproteolyticcleavage.Caspasecascade第二十三頁(yè)，共五十頁(yè)。Thetargetproteinsofcaspase蛋白激酶：FAK,PKC,Raf1；破壞細(xì)胞黏著細(xì)胞支架蛋白:Lamins，IF,actin,gelsilin核酸內(nèi)切酶：CA（CaspaseactivatedDnase）核內(nèi)DNA降解參與DNA修復(fù)的酶：?jiǎn)适迯?fù)活性第二十四頁(yè)，共五十頁(yè)。2.ExtrinsicpathwayandIntrinsicpathwayCaspase3Caspase3Bid第二十五頁(yè)，共五十頁(yè)。非依賴(lài)Caspase途徑線(xiàn)粒體內(nèi)生凋亡途徑：Endo-GAIF第二十六頁(yè)，共五十頁(yè)。（1）胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑·凋亡信號(hào)通路當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;

裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。第二十七頁(yè)，共五十頁(yè)。胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑第二十八頁(yè)，共五十頁(yè)。(2)IntrinsicpathwayThemitochondria-mediatedpathwayofapoptosisVarioustypesofcellularstressBcl-2family:BadorBaxtobecomeinsertedintoOMofMitReleaseofcytochromecfromI-OspaceofMit.Formamultisubunitcomplex;andCaspaseCascade,…促凋亡因子Bad/Bax第二十九頁(yè)，共五十頁(yè)。(2).Bcl-2家族、線(xiàn)粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，能延長(zhǎng)細(xì)胞的生存，而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖，是ced-9在哺乳類(lèi)中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族以不同的調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

◆Bcl-2、線(xiàn)粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2與線(xiàn)粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合，Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡。第三十頁(yè)，共五十頁(yè)。BCL-2家族成員第三十一頁(yè)，共五十頁(yè)。細(xì)胞凋亡的程序——總結(jié)第三十二頁(yè)，共五十頁(yè)。Caspase抑制劑痘病毒蛋白CrmA和桿病毒蛋白p35是天然的caspase抑制劑。CrmA能有效地抑制caspase1和8，P35caspase對(duì)大多數(shù)有較強(qiáng)的抑制作用。在哺乳動(dòng)物中的內(nèi)源caspase抑制劑是編程性死亡抑制因子（inhibitorofapoptosis,IAP）。V－FLIP和FLIP，受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制劑。第三十三頁(yè)，共五十頁(yè)。生死抉擇——凋亡信號(hào)系統(tǒng)第三十四頁(yè)，共五十頁(yè)。在依賴(lài)于p53蛋白的細(xì)胞凋亡中，p53基因是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2和Bax基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡的.p53蛋白能特異地抑制Bcl2的表達(dá)，相反對(duì)Bax的表達(dá)則有明顯的促進(jìn)作用。研究表明，p53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子,在這些細(xì)胞中，p53蛋白的積累和活動(dòng)引起了細(xì)胞凋亡。線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)來(lái)自轉(zhuǎn)錄因子p53.所有腫瘤均表現(xiàn)為p53突變。3.p53蛋白——線(xiàn)粒體凋亡途徑第三十五頁(yè)，共五十頁(yè)。第二節(jié)細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞衰老的分子機(jī)理第三十六頁(yè)，共五十頁(yè)。一、Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限 ◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài) 已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞◆細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)◆物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系 ●二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老第三十七頁(yè)，共五十頁(yè)。細(xì)胞來(lái)源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)

40-60

20

2-4不同年齡來(lái)源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)第三十八頁(yè)，共五十頁(yè)。二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見(jiàn)的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會(huì)不會(huì)衰老？◆衰老動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長(zhǎng);◆衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說(shuō)明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢.第三十九頁(yè)，共五十頁(yè)。三、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化

●細(xì)胞核的變化：細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大細(xì)胞核的核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化?！駜?nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線(xiàn)粒體的變化:細(xì)胞中線(xiàn)粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大●致密體的生成：脂褐質(zhì)，血褐質(zhì)，脂色素等●膜系統(tǒng)的變化：

衰老的細(xì)胞，其膜流動(dòng)性降低、韌性減小衰老細(xì)胞間間隙連接;

細(xì)胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化第四十頁(yè)，共五十頁(yè)。細(xì)胞核的變化◆體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大細(xì)胞核的核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化

第四十一頁(yè)，共五十頁(yè)。四、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理●氧化性損傷學(xué)說(shuō)：代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS---.O2，.OH，

H2O2

），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。脅迫誘導(dǎo)早熟性衰老?！穸肆Ｅc衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說(shuō)（Harley,1990）。復(fù)制衰老。單細(xì)胞生物的衰老：●

rDNA與衰老:酵母染色體外rDNA

環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老?！?/p>

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（Sircomplex）與衰老：Sircomplex存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點(diǎn)DNA轉(zhuǎn)錄?！?/p>

SGS1基因和WRN基因與衰老：SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;

酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突變引發(fā)早老癥.●

發(fā)育程序與衰老:●

線(xiàn)粒體DNA與衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細(xì)胞衰老有關(guān).

第四十二頁(yè)，共五十頁(yè)。1.自由基理論：氧化性損傷學(xué)說(shuō)最初是由Harman于1956年提出來(lái)的,該理論認(rèn)為：在生物氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些活性氧基團(tuán)或分子，它們可以導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老，這就是所說(shuō)的自由基理論。自由基是指那些在原子核外層軌道上具有不成對(duì)電子的分子或原子基團(tuán)。通常所說(shuō)的自由基是指氧自由基，如O2-、OH-、H2O2等。

氧代謝中很多酶促反應(yīng)都可能產(chǎn)生自由基，如黃嘌呤（次黃嘌呤）氧化為尿酸。線(xiàn)粒體呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)會(huì)引發(fā)氧自由基O2－·和羥自由基OH·。第四十三頁(yè)，共五十頁(yè)。

細(xì)胞中的自由基若不能及時(shí)除去，過(guò)多的自由基對(duì)許多細(xì)胞造成損傷：使質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸氧化；使蛋白質(zhì)中的疏基氧化造成蛋白質(zhì)交聯(lián)，變性和酶鈍化；使糖類(lèi)化合物降解；使DNA鏈斷裂、交聯(lián)，堿基羥基化和堿基切除等等。同時(shí)還能抑制蛋白質(zhì)、核酸和脂肪酸的生物合成。其中可能對(duì)磷脂的氧化和對(duì)DNA造成損傷是主要的，也是很致命的。

第四十四頁(yè)，共五十頁(yè)。細(xì)胞內(nèi)清除自由基的機(jī)制細(xì)胞內(nèi)部自身隔離:如線(xiàn)粒體保護(hù)性的酶:細(xì)胞內(nèi)具有多種抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)存在，它們都是自由基反應(yīng)的有效終止劑。如超氧化物歧化酶（SOD），過(guò)氧化氫酶（CAT）以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GHS－PX）?？寡趸肿尤缇S生素E、維生素C

第四十五頁(yè)，共五十頁(yè)。2.端粒與衰老1990年Harley等人用人工合成的(TTAGGG)作為探針，對(duì)胎兒、新小兒、青年人及老年人的成纖維細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度隨年齡增長(zhǎng)下降。在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，端粒長(zhǎng)度則隨著分裂次數(shù)的增加而下降。在這些研究的基礎(chǔ)上，提出了細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，隨著細(xì)胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短達(dá)到一個(gè)閾值時(shí)，細(xì)胞就進(jìn)入衰老。第四十六頁(yè)，共五十頁(yè)。端粒