光化學傳感器理論與實踐第七章優(yōu)秀課件

光化學傳感器理論與實踐第七章第一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識別原理第二節(jié)基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第二頁，共七十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)識別原理

生物修飾傳感組成：由內(nèi)傳感器(普通光學波導傳感器或化學修飾光化學傳感器)和修飾的生物敏感層組成。

第三頁，共七十三頁，2022年，8月28日

識別原理：在生物修飾傳感器中，修飾的生物敏感層在對分析對象進行生物識別的同時，能向普通光學波導傳感器或化學修飾光化學傳感器提供可檢測的光學信號。第四頁，共七十三頁，2022年，8月28日

特點：與分子或離子化學識別相比，生物識別有更高的選擇性與靈敏度。

第五頁，共七十三頁，2022年，8月28日具有生物識別功能的生物物質(zhì)

生物修飾敏感層目前應用：生物修飾敏感層主要涉及酶，抗原或抗體。酶微生物抗原或抗體激素抗體結合蛋白植物凝血素第六頁，共七十三頁，2022年，8月28日酶相關知識酶的定義：是一類具有催化活性的蛋白質(zhì)分子。活性基團種類：組氨酸上的咪唑基、絲氨酸上的羥基、半胱氨酸上的巰基等酶特點(優(yōu)點)非常高的催化效率非常高的特異性影響酶活性因素環(huán)境因素：pH值影響(最佳：生理pH7.4),抑制劑(Ag+、Hg2+、As3+等)存在使酶失活活性中心的空間構象：獨特的三維結構決定了酶發(fā)揮其活性的基礎第七頁，共七十三頁，2022年，8月28日

酶分子上的親核基團有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，這些富含電子的基團(有孤對電子)，攻擊底物分子中電子云密度較小的親電子基團，并供出電子，二者形成共價鍵，酶和底物形成一個不穩(wěn)定的中間物，進而轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。蛋白質(zhì)中三種主要的親核基團第八頁，共七十三頁，2022年，8月28日全酶的結構與分子組成全酶酶蛋白活性中心輔助因子蛋白鏈第九頁，共七十三頁，2022年，8月28日底物

活性中心以外的必需基團結合基團

催化基團

活性中心

多肽鏈圖7-1酶活性中心示意圖底物敏感鏈第十頁，共七十三頁，2022年，8月28日類別功能舉例氧化還原酶促進電子或氫轉(zhuǎn)移葡萄糖氧化酶轉(zhuǎn)移酶促進化學基團轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)氨酶水解酶促進水解反應蛋白、淀粉酶裂解酶促進消去反應形成雙鍵碳酸酐酶異構酶促進同分異構體的相互轉(zhuǎn)變磷酸葡萄糖變化酶連接酶促進鍵的形成，同時使ATP分子中的高能磷酸鍵斷裂谷氨酰胺合成酶酶的分類第十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日目前主要限于：氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶。原因：常常伴隨有可供光學檢測的物質(zhì)的產(chǎn)生或消耗;可直接采用普通光學波導傳感器作為內(nèi)傳感器器件;有時酶所催化的化學反應可能不產(chǎn)生或不消耗可供檢測的物質(zhì)，但往往伴隨有易于被化學修飾光化學傳感器檢測的物質(zhì)（例如H＋、O2、NH3等）的生成與消耗。酶在光化學傳感器中應用第十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日酶分化反應速率方程(一)

E+SESP+E

(酶)(底物)(中間物)(產(chǎn)物)(酶)K1K-1K1葡萄糖(S)己糖激酶(E)復合物(ES)誘導契合作用例如：第十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日酶分化反應速率方程(二)穩(wěn)態(tài)近似法：米氏方程(一):

米氏方程(二):

第十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日光學波導內(nèi)傳感器生物催化層底物產(chǎn)物酶圖7-2酶催化光化學傳感器識別原理底物產(chǎn)物樣品檢測器光極第十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日識別過程傳質(zhì)擴散底物(分析對象)：樣品相生物催化層產(chǎn)物：生物催化層樣品相

穩(wěn)態(tài)響應信號：產(chǎn)物生成速度恰好等于產(chǎn)物離開生物層的凈速度。分析對象濃度測定根據(jù)校正曲線+穩(wěn)態(tài)響應信號(快響應)根據(jù)校正曲線+反應速率(響應時間較長)第十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日免疫反應免疫反應：當動物體收到外界異性物質(zhì)（抗原）的侵入時，動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)細胞就會產(chǎn)生一種與這些異性物質(zhì)相對抗的物質(zhì)（抗體），通過抗體與抗原的結合使抗原的作用消失。第十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日免疫反應抗原：具有免疫原性與抗原特異性。按來源可分為天然抗原、人工抗原和合成原。一般為具有較大分子量的生物活性物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多糖、核酸等，有時為小分子活性物質(zhì)(半抗原)，藥物，激素，肽等。第十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日免疫反應抗體：是一類稱為免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。五種免疫球蛋白包括IgG(主要)、IgA、IgM、IgD、IgE。第十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日-COOH端-NH2端圖7-3IgG分子結構示意圖結合抗原碎片F(xiàn)ab可結晶碎片F(xiàn)c重鏈（heavychain，H鏈）450～550個氨基酸殘基，分子量約55～75kD。根據(jù)Ig重鏈抗原性的差異，Ig可分為五類即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，相應H鏈為γ、μ、α、δ及ε鏈。第二十頁，共七十三頁，2022年，8月28日五種免疫球蛋白結構示意圖第二十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日抗體與抗原的結合力非極性作用氫鍵力作用庫侖力作用分子間吸引力立體排斥力通過-NH2-OH作用通過非極性側(cè)鏈作用通過兩側(cè)鏈相反電荷吸引通過范德華力作用通過結合部電子云互補抗原-抗體結合力的主要貢獻者抗體識別抗原分子的基礎第二十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日免疫光化學傳感器響應免疫光化學傳感器響應特點：與熱力學平衡有關第二十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日免疫光化學傳感器響應抗原抗體檢測無需標記：抗原-抗體結合前后會引起體系熒光強度或偏振程度的變化而直接被檢測。需標記：無光學性質(zhì)變化，進行熒光標記?；虻诙捻?，共七十三頁，2022年，8月28日降低抗原-抗體結合力提高光化學傳感器的可逆性措施1.減少主體溶劑極性降低抗體－抗原之間的疏水相互作用從而降低抗原與抗體結合力(消極，因為：結合力發(fā)、靈敏度下降)2.通過改變測量溫度降低結合力的方法(消極)3.通過緩釋技術，或競爭結合原理可以作成可逆響應的光化學傳感器(積極)第二十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識別原理第二節(jié)基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第二十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)基于普通光學波導傳感器

的酶催化傳感器概念：當酶催化反應直接產(chǎn)生或消耗可供光學檢測的物質(zhì)時，可將相應的酶固定于普通光學波導傳感器的探頭上，構成酶催化傳感器。第二十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)基于普通光學波導傳感器

的酶催化傳感器類型(根據(jù)檢測信號分)紫外吸收熒光(NADH體系

)化學發(fā)光(Luminol)第二十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日探測光纖信號光纖尼龍網(wǎng)堿性磷酸脂酶+404nm樣品+酶鎢燈例：基于堿性磷酸酯酶的普通光化學傳感器基于紫外吸收信號檢測的酶催化傳感器對-硝基苯基磷酸鹽對-硝基酚濾光片404.7nmPMT公共端Anal.Chem.1985,57,565第二十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日基于熒光信號檢測的酶催化傳感器基本上是與輔酶I(煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，NAD)參加的反應聯(lián)系在一起NAD結構式第三十頁，共七十三頁，2022年，8月28日關于輔酶I分子生物學意義：是參與生命體中能量代謝過程的重要物質(zhì)，在反應中主要起遞氫作用。輔酶I類型還原型(NADH)：熒光較強

lEx=360nm,

lEM=460nm氧化型(NAD)：無熒光第三十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日分析對象固定化酶催化反應文獻乳酸、丙酮酸鹵酸脫氫酶乳酸+NAD丙酮+NADH﹝7，8﹞葡萄糖葡萄糖脫氫酶葡萄糖+NAD葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH﹝9﹞膽酸羥基類固醇脫氫酶3-羥基膽酸+NAD膽酸酮+DADH﹝10﹞乙醇醇脫氫酶乙醇+NAD乙醛+NADH﹝7，11﹞蘋果酸、草酸鹽蘋果酸脫氫酶蘋果酸+NAD草酸鹽+NADH﹝12﹞甘油-3-磷酸葡糖-6-磷酸-脫氫酶甘油-3-磷酸+NAD6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH﹝12﹞3-羥基-丁酸3-羥基-丁酸脫氫酶3-羥基-丁酸+NAD乙酰乙酸+NADH﹝12﹞輔酶I醇脫氫酶乙醇+NAD乙醛+NADH﹝12﹞睪酮雄（甾）酮羥基類固醇脫氫酶睪酮雄（甾）酮+NAD類固醇+NADH﹝12﹞表7-3檢測NADH熒光的脫氫酶催化傳感器第三十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日與NADH生成反應耦合NADHNAD++心肌黃酶與NADH反應產(chǎn)生更強熒光產(chǎn)物刃天青(無熒光)9-羥基異吩噁唑(強熒光)靈敏度提高2倍2.與NADH反應產(chǎn)生紫外可見吸收NADHNAD++噻唑藍紫色甲臜強吸收lmax=558nm

心肌黃酶第三十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日硫胺素+H2O2HRP基于其它熒光體系的酶催化傳感器基于辣根過氧化酶(HRP)催化硫胺素的H2O2熒光傳感器：HRP結構示意圖意義：是繼酶催化NADH熒光傳感器之后另一種非常有意義的酶催化熒光傳感器檢測H2O2本身；可檢測在酶催化反應中生成H2O2的生物活性物質(zhì)(底物)硫胺熒(強熒光)+二硫化硫胺素(無熒光)第三十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日基于化學或生物發(fā)光信號檢測的酶催化傳感器該傳感器的顯著特點：體系只需要通過光學波導器件收集信號光，可直接將生物催化層修飾在光電檢測器上。基于化學或生物發(fā)光的酶催化反應體系魯米諾(Luminol)+H2O2化學發(fā)光體系(最經(jīng)典)ATP-熒光素-O2-熒光素酶生物發(fā)光體系NADH-黃素單核苷酸(FMN)-氧化還原酶-O2-熒光素酶生物分化發(fā)光體系第三十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日魯米諾(Luminol)+H2O2化學發(fā)光體系許多氧化酶催化的反應伴隨有H2O2產(chǎn)生，將氧化酶與過氧化酶固定在一起可建立靈敏的化學發(fā)光酶催化傳感器，用于檢測底物，如：尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、膽固醇、胺類、丙酮酸等。第三十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日ATP-熒光素-O2-熒光素酶生物發(fā)光體系ATP+熒光素+O2AMP+氧化熒光素+PPi+CO2熒光素酶hn(lmax=560nm)應用：檢測ATP，DL=10-10molL-1其它有ATP參與的代謝過程所涉及的反應物由Blum等人提出(Anal.Chim.Acta,1989,227,387)

第三十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日NADH-黃素單核苷酸(FMN)-氧化還原酶-O2-熒光素酶生物催化發(fā)光體系NADH+H++FMNNAD+FMNH2氧化還原酶FMNH2+RCHO+O2FMN+RCOOH+H2O熒光素酶hn(lmax=490nm)第三十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日應用測定輔酶I(NADH)：

C.Haggertyet.al.,Anal.Biochem.,88,162(1978)檢測其它底物：與相應底物脫氫酶耦合后，參與遞氫作用的輔酶I起指示物質(zhì)的作用L.J.Blumet.al.,Anal.Lett.,21,717(1988)第三十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識別原理第二節(jié)基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第四十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日技術產(chǎn)生背景

有些酶催化的反應不產(chǎn)生或不消耗可直接光學檢測的物質(zhì)，但涉及質(zhì)子的產(chǎn)生與消耗、氧氣的產(chǎn)生與消耗、酸性或堿性氣體(CO2或NH3)產(chǎn)生與消耗。這些物質(zhì)很容易被化學修飾光化學傳感器所檢測，故可采用相應化學修飾光化學傳感器作內(nèi)傳感器構建酶催化傳感器。第四十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日常用的內(nèi)傳感器種類氧光化學傳感器為內(nèi)傳感器；CO2光化學傳感器為內(nèi)傳感器；NH3光化學傳感器為內(nèi)傳感器。第四十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日氧光化學傳感器為基礎光極的酶催化傳感器傳感器的結構與原理：以測量葡萄糖為例第四十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日葡萄糖樣品光學波導O2敏感熒光試劑葡萄糖葡萄糖酸氧化酶葡萄糖酸O2O2O2氣透膜生物催化層探測光激發(fā)信號光發(fā)射尼龍網(wǎng)+圖7-5氧光化學傳感器為基礎光極的葡萄糖生物傳感器內(nèi)傳感器氧光學傳感器第四十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日傳感器的特性樣品中葡萄的濃度越大，傳感器的熒光強度信號越大；檢測范圍0.1~20mmol/L；響應時間幾分鐘之內(nèi)。第四十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日氨氣酶光極傳感器為基礎傳感器的酶催化傳感器傳感器的結構與原理：以測量尿素為例NH2CONH2(尿素)+H2O2NH3+CO2脲酶第四十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日底物樣品光學波導底物NH3脫氨酶NH3氣透膜生物催化層探測光信號光圖7-6以氨氣酶光極為基礎傳感器的酶催化傳感器內(nèi)傳感器氨氣敏光極NH3酶支持膜HINDH+IND-+NH4+H++化學修飾層厚度(m)第四十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日傳感器的特性尿素的濃度越大，產(chǎn)生的NH3氣越多，使內(nèi)感器的吸收或熒光信號變化越明顯；檢測范圍5×10-5~1×10-2

mol/L，DL=5×10-5

mol/L；響應時間約7分鐘。第四十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識別原理第二節(jié)基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第五十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日1.體系:一一對應的免疫體系；適用范圍2.抗原抗體要有熒光活性：有內(nèi)源熒光的抗體（或抗原）：許多抗體或抗原的多肽鏈含有熒光活性的氨基酸殘基礎，如：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。第五十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日熒光標記后的抗體（或抗原）對標記物的要求：

(1)穩(wěn)定；(2)熒光發(fā)射光譜與背景熒光有明顯差別；(3)高熒光量子產(chǎn)率；(4)大的Stokes位移；(5)有合適的與抗原或抗體連接的法；(6)不影響抗原-抗體結合反應。第五十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日

主要基于抗原-抗體作用前后熒光強度的變化：非輻射熒光能量轉(zhuǎn)移：熒光熄滅

例：半抗原2,4-二硝基苯(DNP)DNP-賴氨酸+抗體→DNP-賴氨酸/抗體(有熒光活性)(無熒光活性)簡單免疫熒光分析原理第五十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日輻射熒光能量轉(zhuǎn)移：熒光增強例：二甲氨基萘-5-磺酰(DANS)DANS-賴氨酸+抗體→DANS-賴氨酸/抗體(有熒光活性)(強熒光活性)熒光強度增加25-30倍抗原抗體結合前后微環(huán)境變化引起熒光增強度變化第五十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日構建基于簡單免疫體系的光化學傳感器1.采用熒光標記物的簡單免疫體系構造光化學傳感F.V.Brightetal.,Anal.Chem.,62,1065(1990)第五十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日光纖端部HSA：人血清白蛋白Fab：抗人血清白蛋白抗體碎片熒光試劑：丹酰氯Fab

與HSA結合后使熒光標記物的微環(huán)境改變，熒光增強KSCN溶液能將Fab與HSA分開，從而使傳感器再生。第五十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.酶聯(lián)免疫光化學傳感T.Vo-Dinhetal.,Appl.Spectrosc.,40,696(1986)非熒光物質(zhì)：與磷酸根相結合的4-甲基傘形酮與抗體結合的酶：堿性磷酸酯酶酶催化分解產(chǎn)物：4-甲基傘形酮酶，強熒光活性第五十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日EEEEEEEE激發(fā)發(fā)射酶催化反應固定在池壁上的待測抗原非熒光酶底物E酶聯(lián)抗體酶催化產(chǎn)生的熒光活性物質(zhì)激發(fā)態(tài)的熒光活性物質(zhì)圖7-9酶聯(lián)免疫熒光傳感器原理示意圖第五十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日定量分析的依據(jù)：樣品中抗原濃度越大，結合酶聯(lián)抗體就越多，催化水解產(chǎn)生的游離4-甲基傘形酮越多，強熒光強度越強。第六十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識別原理第二節(jié)基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第六十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第五節(jié)基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日原理：Optode-Ag+Ab*+AbOptode-Ag-Ab*+Optode-Ag-AbOptode-Ab+Ag*+AgOptode-Ab-Ag*+Optode-Ab-Ag或樣品中待測Ag(或Ab)越多，結合到光極探頭上的標記物抗原Ag*(或標記抗體Ab*)越少，傳感器的熒光強度越低。第六十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日有可逆響應的葡萄糖免疫光化學傳感器J.S.Schultzetal.,DiabetesCare,5,245(1982)第一個真正有可逆響應的免疫光化學傳感器。所有基于熒光標記競爭的免疫體系均可以按此設計思想制成有可逆響應的光化學傳感器。第六十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日激發(fā)發(fā)射葡萄糖熒光素標記的葡聚糖固定化刀豆球蛋白激發(fā)態(tài)熒光素標記葡聚糖樣品光纖滲析管圖7-11有可逆響應的葡萄糖免疫光化學傳感器第六十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日基于熒光能量轉(zhuǎn)移的競爭免疫傳感器原理：當對抗原和抗體標記不同熒光物質(zhì)時，若一個標記物的熒光發(fā)射光譜與另一個標記物的熒光吸收光譜重疊則抗原與抗體結合的同時可能發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移。第六十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日hnhn標記1標記2AgAb能量轉(zhuǎn)移Ag-Ab熒光能量轉(zhuǎn)移的結果：一個標記物的熒光消失，另下標記物的熒光能量增強。熒光能量轉(zhuǎn)移圖示第六十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日應用1.測葡萄糖：Schultzetal.,Talanta,35,145(1988)Ag：葡聚糖(半抗原)；標記物：熒光素異硫氰酸酯(FITC)。Ab：刀豆球蛋白A；標記物：羅丹明(Rh)。葡萄糖濃度↑，游離的Ag-FIT