光學(xué)檢測(cè)技術(shù)張靜

光學(xué)檢測(cè)技術(shù)張靜第一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)旋光檢測(cè)技術(shù)利用旋光計(jì)測(cè)量出旋光物質(zhì)（光學(xué)活性物質(zhì)）對(duì)偏振光旋轉(zhuǎn)角度的方向（左旋或右旋）和大小，從而進(jìn)行定性與定量分析的技術(shù)，稱為旋光檢測(cè)技術(shù)。旋光物質(zhì)對(duì)偏振光的旋轉(zhuǎn)方向和角度大小是該物質(zhì)的固有特性。偏振光旋轉(zhuǎn)的方向和角度稱為旋光度。左旋（－），右旋（＋）。物質(zhì)的旋光度主要取決于物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，此外與入射光的波長(zhǎng)及溫度有關(guān)，對(duì)溶液而言，還與溶液性質(zhì)、溶液濃度和溶液厚度有密切關(guān)系。第二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

旋光法：應(yīng)用旋光儀測(cè)量旋光性物質(zhì)的旋光度以確定其含量的分析方法。

旋光度和比旋光度是旋光性物質(zhì)的主要物理性質(zhì)。通過(guò)旋光度和比旋光度的測(cè)定，可以檢查光學(xué)活性化合物的純度，也可以定量分析有關(guān)化合物溶液的濃度。第三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日光是一種電磁波，即光波的振動(dòng)方向與其前進(jìn)方向互相垂直。自然光有無(wú)數(shù)個(gè)與光的前進(jìn)方向互相垂直的光波振動(dòng)面。若光線前進(jìn)的方向指向我們，則與之互相垂直的光波振動(dòng)平面可表示為如圖（a），圖中箭頭表示光波振動(dòng)的方向。若使自然光通過(guò)尼科爾棱鏡，由于振動(dòng)面與尼科爾棱鏡的光軸平行的光波才能通過(guò)尼科爾棱鏡，所以通過(guò)尼科爾棱鏡的光，只有一個(gè)與光的前進(jìn)方向互相垂直的光波振動(dòng)面，如圖（b）。這種僅在一個(gè)平面上振動(dòng)的光叫偏振光。

自然光與偏振光第四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日通常用以下兩種方法產(chǎn)生偏振光：尼科爾棱鏡或偏振片。尼科爾棱鏡一塊方解石的菱形六面體末端的表面磨光，使鏡角等于68°，將之對(duì)角切成兩半，把切面磨成光學(xué)平面后，再用加拿大樹(shù)膠粘起來(lái)，便成為一個(gè)尼科爾棱鏡。其中非常光線MP由方解石到加拿大樹(shù)膠是由光疏介質(zhì)到光密介質(zhì)，必將發(fā)生折射通過(guò)加拿大樹(shù)膠，由棱鏡的另一端面射出，從而產(chǎn)生了平面偏振光。偏振光的產(chǎn)生尼科爾棱鏡示意圖第五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日偏振片

利用偏振片也能產(chǎn)生偏振光。它是利用某些雙折射晶體（如電氣石）的二色性，即可選擇性吸收尋常光線，而讓非常光線通過(guò)的特性，把自然光變成偏振光。

第六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分子結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，能把偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)一定角度的物質(zhì)稱為光學(xué)活性物質(zhì)。許多食品成分都具有光學(xué)活性，如單糖、低聚糖、淀粉以及大多數(shù)的氨基酸和羥酸等。其中能把偏振光的振動(dòng)平面向右旋轉(zhuǎn)的，稱為“具有右旋性”，以（十）號(hào)表示；反之．稱為“具有左旋性”，以（一）號(hào)表示。旋光性、旋光性物質(zhì)第七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日旋光度偏振光通過(guò)光學(xué)活性物質(zhì)的溶液時(shí)，其振動(dòng)平面所旋轉(zhuǎn)的角度叫做該物質(zhì)溶液的旋光度，以α表示。旋光度的大小與光源的波長(zhǎng)、溫度、旋光性物質(zhì)的種類(lèi)、溶液的濃度及液層的厚度有關(guān)。對(duì)于特定的光學(xué)活性物質(zhì)，在光源波長(zhǎng)和溫度一定的情況下，其旋光度α與溶液的濃度c和液層的厚度L成正比。即：α＝KcL第八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日比旋光度

當(dāng)旋光性物質(zhì)的濃度為100g/100ml，液層厚度為ldm（分米）時(shí)所測(cè)得的旋光度稱為比旋光度，以表示。由上式可知：＝K×1×1＝K

即：＝式中：[α]－－比旋光度，度；

t－－溫度，

λ－－光源波長(zhǎng)，nm；

α－－旋光度，度；

L－－液層厚度或旋光管長(zhǎng)度，dm；

c－－溶液濃度，g／ml。第九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

比旋光度與光的波長(zhǎng)及測(cè)定溫度有關(guān)。通常規(guī)定用鈉光D線（波長(zhǎng)

589.3nm）在20℃時(shí)測(cè)定，在此條件下，比旋光度用表示因在一定條件下比旋光度是已知的，L為一定，故測(cè)得了旋光度就可計(jì)算出旋光質(zhì)溶液中的濃度c。第十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日變旋作用定義具有光學(xué)活性的還原糖類(lèi)（如葡萄糖，果糖，乳糖、麥芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初迅速變化，然后漸漸變得較緩慢，最后達(dá)到恒定值，這種現(xiàn)象稱為變旋作用。

第十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日這是由于有的糖存在兩種異構(gòu)體，即α型和β型，它們的比旋光度不同。這兩種環(huán)型結(jié)構(gòu)及中間的開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)在構(gòu)成一個(gè)平衡體系過(guò)程中，即顯示出變旋光作用。變旋現(xiàn)象

因此，在用旋光法測(cè)定蜂蜜，商品葡萄糖等含有還原糖的樣品時(shí)，樣品配成溶液后，宜放置過(guò)夜再測(cè)定。若需立即測(cè)定，可將中性溶液（pH=7）加熱至沸，或加幾滴氨水后再稀釋定容；若溶液已經(jīng)稀釋定容，則可加入碳酸鈉干粉至石蕊試紙剛顯堿性。在堿性溶液中，變旋光作用迅速，很快達(dá)到平衡。但微堿性溶液不宜放置過(guò)久，溫度也不可太高，以免破壞樣品。第十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日旋光儀WXG型半蔭旋光儀檢糖計(jì)WZB自動(dòng)旋光儀第十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日WGX型半蔭旋光儀結(jié)構(gòu)和原理

起偏棱鏡一般用尼科爾（Nicol)棱鏡，以獲得偏振光。旋光管盛裝待測(cè)液的玻璃管。檢偏棱鏡仍用尼科爾（Nicol)棱鏡，用以檢測(cè)從旋光管射出的偏振光振動(dòng)平面與原來(lái)相比較的角度（可由刻度盤(pán)上的數(shù)值讀出）。第十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日檢糖計(jì)

檢糖計(jì)專用于糖類(lèi)的測(cè)定。故刻度數(shù)值直接表示為蔗糖的百分含量（W/V），其測(cè)定原理與旋光計(jì)相同。在結(jié)構(gòu)上有以下特點(diǎn)檢糖計(jì)的基本光學(xué)元件第十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日自動(dòng)旋光儀當(dāng)檢測(cè)池中放進(jìn)存有被測(cè)溶液的試管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋轉(zhuǎn)了一個(gè)角度，零度視場(chǎng)便發(fā)生了變化，轉(zhuǎn)動(dòng)檢偏鏡一定角度，能再次出現(xiàn)亮度一致的視場(chǎng)。這個(gè)轉(zhuǎn)角就是溶液的旋光度，測(cè)得溶液的旋光度后，就可以求出物質(zhì)的比旋度。根據(jù)比旋度的大小，就能確定該物質(zhì)的純度和含量了。第十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日旋光法測(cè)定味精濃度樣品溶液配制精確稱取味精樣品10.00g，加40～50mL蒸餾水溶解，攪拌加入分析純鹽酸16mL，使味精全部溶解。冷卻至室溫，蒸餾水定容至100mL。旋光儀調(diào)零預(yù)熱10min，放進(jìn)濾光片。取16mL分析純鹽酸蒸餾水定容至100mL。裝滿旋光管，調(diào)整零點(diǎn)。樣品液測(cè)定樣品洗滌旋光管三次，裝滿旋光管，放進(jìn)樣品室，測(cè)定旋光度，記錄溫度。第十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日物質(zhì)被輻射能照射后，分子內(nèi)部獲得外源能量，基態(tài)分子能級(jí)的電子躍遷到較高能級(jí)，轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)分子能級(jí)，使分子處在高能域不穩(wěn)定狀態(tài)，因此，它必須釋放多余的能量，變成穩(wěn)定狀態(tài)的分子。分子發(fā)光：由激發(fā)態(tài)能級(jí)回到基態(tài)能級(jí)的過(guò)程中以光的形式釋放多余的能量，并發(fā)射出比原波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光譜。熒光分光光度法：檢測(cè)分子發(fā)射光譜的分析方法。第二節(jié)熒光檢測(cè)技術(shù)第十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日一、特點(diǎn)專一性強(qiáng)靈敏度高：測(cè)定同樣濃度物質(zhì)的含量，通常比吸收光譜靈敏度高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)左右。選擇性強(qiáng)：既可分析發(fā)射光譜，也可分析激發(fā)光譜，偏振光譜。發(fā)光方式多：物理發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光?？煞治鰠?shù)多：可分析熒光光譜，熒光強(qiáng)度，熒光效率，熒光壽命等多種物理參數(shù)。

第二十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日二、方法原理熒光現(xiàn)象：是一種發(fā)光現(xiàn)象，當(dāng)一種波長(zhǎng)的光照射在某一熒光物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)被激發(fā),若能在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光,在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間大約10-8~10-4s.發(fā)射的光譜稱為熒光光譜.磷光光譜:

若這種光在激發(fā)態(tài)停留較長(zhǎng)的時(shí)間,即在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間大約是10-4~10s,系統(tǒng)內(nèi)發(fā)射出比熒光波長(zhǎng)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光.發(fā)射的光譜稱為磷光光譜.第二十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光產(chǎn)生機(jī)理（1）分子能級(jí)：最低第一級(jí)電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)是產(chǎn)生熒光的基礎(chǔ)。分子吸收能量后，電子躍遷到哪一個(gè)能級(jí)并不重要，重要的是吸收了能量的分子經(jīng)過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)移以后，將能量降到最低第一級(jí)電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)后，能否以光子的形式釋放能量，如能就會(huì)發(fā)射熒光，否則不會(huì)。第二十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）耗能方式:產(chǎn)生熒光:分子內(nèi)在因素和外在條件決定.在同一能級(jí)中分子間的相互碰撞消耗能量;無(wú)輻射衰減轉(zhuǎn)給周?chē)肿幼兂烧駝?dòng)能消耗;輻射熒光----以光子的形式釋放能量;光分解消耗分子內(nèi)部的能量(光分解以產(chǎn)生熱的方式，使物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光能量減弱或喪失).第二十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）能量的傳遞途徑:

處于較高能級(jí)的激發(fā)態(tài)電子回到基態(tài)途徑第二十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾缕湔駝?dòng)能級(jí)發(fā)生重疊時(shí)，電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移給低能級(jí)不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，如S1→T1。有時(shí)通過(guò)熱激發(fā)，就有可能發(fā)生T1→S1，然后產(chǎn)生延遲熒光被激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用把多余的能量轉(zhuǎn)移給周?chē)肿樱篃晒饣蛄坠獍l(fā)射的強(qiáng)度減弱或消失。也稱熒光熄滅或猝滅激發(fā)態(tài)分子把多余的振動(dòng)能量以熱的形式轉(zhuǎn)給周?chē)肿?，而自身從Sn的較高振動(dòng)能級(jí)層降低到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)層上處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子回到基態(tài)振動(dòng)能級(jí)時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)發(fā)射一個(gè)光子返回到基態(tài)分子的系間竄躍躍遷后，就會(huì)發(fā)生快速的振動(dòng)弛豫到達(dá)第三激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)上，以光子的形式躍遷回到基態(tài)第二十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（4）分子熒光的類(lèi)型:

根據(jù)熒光物質(zhì)所需的激發(fā)光源不同和吸能后發(fā)射熒光光譜的差異,分為:物理發(fā)光(物理/光致熒光）：熒光分子吸收了光能(如以X射線，紫外光，激光等為光源的輻射能等)而產(chǎn)生的熒光;化學(xué)發(fā)光:通過(guò)分子與分子之間的化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)能，在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中釋放能量而發(fā)射熒光;生物發(fā)光:通過(guò)生物體內(nèi)的熒光酶與熒光物質(zhì)相互作用，在生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所釋放出來(lái)的光能.

第二十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日2.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光化合物的分子在吸收能量和釋放能量的過(guò)程中，都存在著激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜：熒光分子首先要從外界得到相應(yīng)的能量，才能具備發(fā)光的基本條件,才有可能發(fā)射熒光。在選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，可通過(guò)測(cè)量分子的激發(fā)光譜來(lái)確定。第二十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)射光譜：分子發(fā)射熒光的特征波長(zhǎng)比吸收的特征波長(zhǎng)長(zhǎng)。發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光譜極為相似,且呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。第二十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日3.熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)（1）熒光分子產(chǎn)生熒光的條件：熒光分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，能吸收激發(fā)光提供的輻射能；分子吸收了與本身特征頻率相同能量后，必須具有產(chǎn)生一定的熒光量子的能力。產(chǎn)生熒光量子的強(qiáng)弱可用熒光量子產(chǎn)率（也稱熒光效率或量子效率）來(lái)表示：第二十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系：共軛效應(yīng)：含有π-π*電子躍遷能級(jí)化合物的熒光最強(qiáng)。絕大多數(shù)能發(fā)射熒光的化合物，都是芳香族或雜環(huán)類(lèi)化合物或者在它們的分子中含有芳香族或雜環(huán)類(lèi)基團(tuán)。苯類(lèi)化合物的對(duì)苯基化、間苯基化及乙烯化作用能夠增強(qiáng)苯分子的熒光強(qiáng)度。第三十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分子的剛性平面結(jié)構(gòu)：能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光。這種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子相互之間的作用降低了，這樣更有利于熒光的發(fā)射（如芴和聯(lián)二苯的熒光效率分別為1.0和0.2；熒光素有很強(qiáng)的熒光，而酚酞沒(méi)有熒光）。第三十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日取代效應(yīng)：給電子基團(tuán)（如-OH，-OR，-NH2，

-CN，-NR等）能使熒光增強(qiáng)，得電子基團(tuán)（如-COOH，-C=O，-NO2，-NO及鹵素離子等）能使熒光減弱第三十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日三、儀器的結(jié)構(gòu)與原理1.熒光分光光度法定量分析基本原理

溶液的熒光強(qiáng)度和該溶液吸收光能的程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光量子效率有關(guān)。第三十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日2.熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)激發(fā)光源,激發(fā)單色器,樣品池,發(fā)射單色器,檢測(cè)器及顯示系統(tǒng)激發(fā)光源：要求能發(fā)出強(qiáng)度較大，連續(xù)穩(wěn)定的光源。

理論上,發(fā)射熒光的強(qiáng)度取決于激發(fā)光源的強(qiáng)度.實(shí)際應(yīng)用中選擇光源的強(qiáng)度不能太強(qiáng)也不能太弱。要根據(jù)熒光物質(zhì)的性質(zhì)選擇合適光源:對(duì)光敏感或發(fā)射熒光較強(qiáng)的物質(zhì)選用較弱光源,反之可選較強(qiáng)光源.第三十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日測(cè)量熒光強(qiáng)度儀器：濾光片熒光分光光度計(jì)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的精密熒光分光光度計(jì)。主要部件：激發(fā)光源:

前者常用汞燈,后者常用氙燈(250~700nm).濾光片和單色器：前者采用兩個(gè)濾光片(激發(fā)濾光片/熒光濾光片)；后者采用光柵作單色器。樣品池：低熒光的玻璃或石英制成，形狀以散射光較少的方形為宜。檢測(cè)器：阻擋層光電池(500~600nm最靈敏)，缺點(diǎn)：易疲勞，靈敏度低；光電倍增管檢測(cè)器：靈敏度高，使用簡(jiǎn)單，特別適用于強(qiáng)度微弱光的測(cè)量。第三十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)技術(shù)（影響熒光分析的因素）

溶液的pH的影響：在溶液中，絕大多數(shù)熒光物質(zhì)都是以離子狀態(tài)形式存在的，發(fā)射熒光的最佳條件是解離的熒光分子。

溫度的影響:

溫度升高，熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光效率和熒光強(qiáng)度都會(huì)下降，反之。溶劑的影響：熒光物質(zhì)的熒光波峰位置和熒光強(qiáng)度與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)。不同溶劑對(duì)各種熒光物質(zhì)發(fā)生熒光的影響程度是不同的，某些溶劑可使熒光物質(zhì)形成配合物，某些溶劑可改變熒光物質(zhì)的解離狀態(tài)。第三十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日激發(fā)光源的影響：光分解:熒光化合物被強(qiáng)激發(fā)光照射會(huì)發(fā)生分解，引起熒光強(qiáng)度迅速下降。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。器皿污染的影響：器皿內(nèi)壁含極少量熒光物質(zhì)，會(huì)使測(cè)定結(jié)果造成偏差，最好用30%硝酸清洗。內(nèi)濾效應(yīng)的影響：在樣品溶液中存在著雜質(zhì)或測(cè)試樣品池濃度太大引起熒光變?nèi)醯默F(xiàn)象。自吸收：樣品濃度大，熒光分子吸收光能和發(fā)射熒光的同時(shí)有部分重疊，而引起可檢測(cè)的熒光強(qiáng)度變?nèi)?。雜質(zhì)吸收：樣品溶液中存在能吸收激發(fā)光或發(fā)射光能量的雜質(zhì)，使檢測(cè)到的光強(qiáng)度變?nèi)酢?/p>

第三十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日稀樣品溶液的影響:氧化作用：熒光物質(zhì)的稀溶液不如濃度高的溶液穩(wěn)定，易發(fā)生氧化作用(腎上腺素，1μg/mL，100μg/mL)

光分解：稀溶液相對(duì)于高濃度溶液更易發(fā)生光分解，尤其對(duì)光較敏感的物質(zhì)。

表面吸附：某些非待測(cè)的熒光物質(zhì)吸附在比色皿內(nèi)壁表面上，在分析過(guò)程中這些熒光物質(zhì)發(fā)射相應(yīng)的熒光，干擾測(cè)定。對(duì)稀溶液影響大。另外，表面吸附對(duì)不同溶劑吸附程度不同，有機(jī)溶劑表面吸附更明顯。第三十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日五、熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用根據(jù)發(fā)光機(jī)理，能吸收能量后以光子的形式釋放能量的化合物都屬熒光物質(zhì)。發(fā)光方式分：自熒光物質(zhì)(分子中含熒光發(fā)光基團(tuán)或化學(xué)鍵)外源熒光物質(zhì)(要與某些熒光物質(zhì)或熒光燃料以共價(jià)鍵或離子鍵的形式結(jié)合)

第三十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分析方法:1、定量分析方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）外標(biāo)法（直接比較法）：在一定濃度范圍內(nèi)，選擇一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，將其在熒光分光光度計(jì)上測(cè)得的值與在同樣條件下的未知樣品的值進(jìn)行比較，得出未知樣品的濃度。未知樣品濃度（mg/mL）=(A1/A2)c

式中，A1為未知樣品的熒光發(fā)光值，A2為標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光發(fā)光值，c為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。2、定性分析：根據(jù)熒光發(fā)射的波長(zhǎng)和出現(xiàn)的峰位，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)的某些特征.

第四十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)分光光度檢測(cè)技術(shù)a、目視比色法用眼睛比較溶液顏色的深淺以確定物質(zhì)濃度的方法稱為目視比色法。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便；無(wú)需單色光；準(zhǔn)確度不高。b、分光光度計(jì)基于被測(cè)物質(zhì)的分子對(duì)光具有選擇性吸收的特性而建立起來(lái)的分析方法。包括：第四十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分光光度檢測(cè)技術(shù)

（Chaptertwospectrophotography)

定義:

分光光度檢測(cè)技術(shù)是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù)。

特點(diǎn):靈敏、精確、快速和簡(jiǎn)便，在復(fù)雜組分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì)。

應(yīng)用:

生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測(cè)。第四十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分光光度檢測(cè)的分類(lèi)分光光度檢測(cè)的分類(lèi)紅外分光光度檢測(cè):可見(jiàn)光分光光度檢測(cè):

紫外分光光度檢測(cè):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)

第四十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日一、分光光度計(jì)工作原理第四十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（一）分光光度檢測(cè)的光譜范圍

包括波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

鎢燈的發(fā)射光譜：鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜，光通過(guò)三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。

氫燈的發(fā)射光譜：氫燈能發(fā)出185～400nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外光分光度計(jì)的光源。第四十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（二）物質(zhì)的吸收光譜

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn)了幾條暗線，即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。

不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此根據(jù)溶液的吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。

第四十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日用不同波長(zhǎng)的單色光照射，測(cè)定吸光度，如果以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)即可得一條曲線稱為吸收曲線（~A曲線）。吸收曲線清楚地描述了物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。max=510nm第四十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

（1）不同物質(zhì)吸收曲線的形狀和吸收波長(zhǎng)不同。MnO4-531吸收曲線第四十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同；同一物質(zhì)不同濃度，其吸收曲線形狀相似。

吸收曲線是特征的，可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一；吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。第四十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱。因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚ⅲ徊糠止獗唤M成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過(guò)溶液。入射光=反射光

＋

分散光

＋

吸收光

＋

透過(guò)光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為“空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的損失，則：入射光=吸收光

十

透過(guò)光

第五十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日(三）分光光度計(jì)常用術(shù)語(yǔ)C:測(cè)試溶液的濃度I:透過(guò)光的強(qiáng)度I0

:空白校正后入射光的強(qiáng)度T:透光率（

I/I0）A

:光吸收（OD）L

:比色杯光程第五十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日吸光度A：物質(zhì)對(duì)光的吸收程度。定義：A＝lg（I0/It)A越大，表示對(duì)光的吸收越大，透過(guò)光越弱。（四）依據(jù)原理：朗伯-比爾定律（Lambert–Beer）第五十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

1760年朗伯(Lambert)闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系：A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類(lèi)似的關(guān)系：A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，A∝bc第五十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日朗伯—比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式：

A＝lg（I0/It)=εbc

式中：A，吸光度，無(wú)量剛；b，液層厚度(光程長(zhǎng)度)，cm；c，溶液的濃度，mol·L-1；ε(epsilon)稱為摩爾吸光系數(shù)，L·mol-１·cm-1，僅與入射光波長(zhǎng)、溶液的性質(zhì)及溫度有關(guān)，與濃度無(wú)關(guān)。上式表明：當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，其吸光度與溶液濃度和寬度的乘積成正比。第五十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日T、A、c間的關(guān)系：

A

＝lg（I0/It)=-lgT=εbc

透光度(透光率)T

：透過(guò)光和入射光強(qiáng)度之比，即T=It

/I0×100%T越大，表示對(duì)光的吸收越小。第五十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日朗伯-比爾定律的適用條件單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測(cè)定.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強(qiáng).吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變

離解、絡(luò)合、締合會(huì)破壞線性關(guān)系,應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等).第五十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日吸光度具有加和性：

在多組分體系中，吸光度具有加和性，即：

A（總）＝A1+A2+…+An

=ε1bc+ε2bc+…+εnbc

第五十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日(五）

分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

無(wú)論哪一類(lèi)分光光度計(jì)都包括5個(gè)基本部件：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:

第五十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分光光度計(jì)的基本部件

光源:

分光光度計(jì)上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見(jiàn)光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源；在紫外光區(qū)多使用氫燈。

單色器：把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置。在分光光度計(jì)中多用棱鏡或光柵作為色散元件。

吸收池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用來(lái)盛被測(cè)的溶液。在低于350nm的紫外光區(qū)工作時(shí)，必須采用石英池或熔凝石英池。

第五十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日吸收池（比色皿）必須與光束方向垂直。此外，每套比色皿的質(zhì)料、厚度應(yīng)完全相同，以免產(chǎn)生誤差。比色皿上的指紋、油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性，因此在使用前務(wù)必徹底清洗。第六十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日

檢測(cè)器：常用光電池、光電管和光電倍增管三種。

測(cè)量?jī)x表：一般常用的紫外光和可見(jiàn)光分光光度計(jì)有3種測(cè)量裝置，即電流表、記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元?，F(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器，可自動(dòng)掃描出吸收曲線。

第六十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（六）使用分光光度法測(cè)定樣品溶液濃度的計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法（常用）標(biāo)準(zhǔn)管法標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法回歸分析法第六十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日其方法和步驟是：1）配制一組濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液(c1

、c2

……)；2）在一定波長(zhǎng)下，分別測(cè)定其吸光度(A1、A2……)。3）以A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，繪制曲線，得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（A-c曲線）。4）用完全相同的方法和步驟測(cè)定待測(cè)溶液的吸光度Ax，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的濃度cx值（Ax

cx

）。標(biāo)準(zhǔn)曲線法第六十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日Axcx空白標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)溶液BlankStandardSampleSamplec1c2c3c4cxc0標(biāo)準(zhǔn)曲線第六十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日注意：用比色法測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)