ELISA雙抗夾心法檢測抗原解析

會計學1ELISA雙抗夾心法檢測抗原解析ELISA-測抗原（Ag）或抗體（Ab）三要素抗原或抗體的固相化：已知的Ag/Ab結合到固相載體表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體的酶標記：酶標Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物顯色：底物被酶催化成為有色產物—定性和定量–放大免疫反應的信號基本原理第1頁/共42頁高度特異性：保持抗原抗體反應的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應液顏色深淺或光密度值基本特點第2頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第3頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第4頁/共42頁顯色間接法檢測特異性抗體包被已知抗原與待測抗體孵育與酶標抗體孵育加入底物包被已知抗原第5頁/共42頁優(yōu)點:只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法操作簡單迅捷缺點：可重復性差通常用于抗體效價的檢測和某些疾病的早期診斷第6頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第7頁/共42頁直接競爭法檢測可溶性抗原原理：待檢抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合；待檢抗原含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。第8頁/共42頁優(yōu)點：待檢抗原只需要一個抗原決定簇，適合小分子抗原，如，激素，藥物等；操作步驟簡單快捷，只需要一個保溫洗滌過程缺點：酶標記抗體用量大；定量檢測的靈敏度和重復性存在不足。第9頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原

雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第10頁/共42頁改良雙抗夾心法雙抗體夾心法檢測可溶性抗原雙抗夾心法第11頁/共42頁優(yōu)點：待測抗原需要≥2個抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物就可以建立此法；重復性較好；缺點：操作復雜，費時費力第12頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第13頁/共42頁應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法

（BA-ELISA法）間接包被放大終末反應第14頁/共42頁BA-ELISA原理

BA-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎上，結合生物素(B，biotin)與親和素(A，avidin)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。生物素是動植物體內廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H；親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載體吸附性比前者低）親和素與生物素都可與蛋白質(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結合而不影響后者的生物活性，是理想的標記劑；結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。第15頁/共42頁實驗材料小鼠INF-γ檢測試劑盒的組成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN-γ（定量測定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待測樣品----經ConA活化的小鼠淋巴細胞培養(yǎng)上清第16頁/共42頁ELISA操作要點樣品的保存試劑的準備固相載體包被加樣孵育(溫育）洗滌顯色和比色第17頁/共42頁樣本的制備與保存：血清樣品和細胞培養(yǎng)上清：5天內測定，可以放置于4℃，超過一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴細胞培養(yǎng)上清：分別于活化后不同時間點收集培養(yǎng)的細胞，2000rpm，4℃離心分離上清，冰上放置，分裝第18頁/共42頁試劑的準備ELISA中用的蒸餾水或者去離子水，包括用于配置coatingbuffer，稀釋Assaybuffer，洗滌的，應為新鮮的和高質量的；從冰箱中取出的試劑應該平衡至室溫后使用；試劑最好現(xiàn)配先用第19頁/共42頁固相載體最常用的是聚苯乙烯：有較強的吸附蛋白質的性能；國際上標準的是微量滴定板8×12的96孔板式；已經包被抗原或者抗體的固相載體在低溫（2-8℃）干燥的條件下一般可以保存6個月。第20頁/共42頁包被定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過程稱為包被；物理吸附：兩者的疏水基團通過疏水鍵的作用抗體或者蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液（即本次實驗用的coatingbuffer）4-8℃包被過夜(有利于蛋白活性的保持），與37℃孵育2小時被認為具有相等的包被效果包被的最適當濃度隨著載體和包被物的性質和酶結合物的濃度調定第21頁/共42頁封閉定義：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程；目的：抗原或抗體包被時所用的濃度比較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量的不相關蛋白質填充這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附；常用封閉液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脫脂奶粉；本實驗用封閉液：1×Assaybuffer。第22頁/共42頁加樣ELISA中一般有3次加樣步驟，即，加樣本（和/或標準品），加酶結合物，加底物；加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以濺出,不可以產生氣泡；多道加液器的使用第23頁/共42頁孵育(溫育）在ELISA中抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫的過程稱為孵育；常用溫度：43℃，37℃，室溫，4℃等孵育時為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保鮮膜封板第24頁/共42頁洗滌

洗滌在ELISA中雖然不是一個反應步驟，但決定了實驗的成敗聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清除在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質洗滌可以清除殘留在板孔中沒有能夠與固相抗原或者抗體結合的物質常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團+親水基團），以抑制蛋白質吸附于塑料表面，如吐溫20，0.05%的濃度比較合適，濃度＞2%會洗脫包被在板上的抗原或者抗體第25頁/共42頁洗滌方式：甩干孔內的反應液浸泡，即將洗滌液注滿板孔(約300μl），靜置3min，浸泡時間不可以隨意縮短；甩去液體后在吸水紙上拍干重復操作2，3，洗滌次數(shù)按要求操作第26頁/共42頁顯色和比色

顯色是ELISA中的最后一步孵育反應，此時，酶催化無色的底物生成有色的產物；定量實驗中，加入底物后的反應溫度和時間應該按規(guī)定力求準確；定性測定的顯色時間一般不需要嚴格控制和及時判斷；終止反應，防止反應過度：

TMB受光照影響不大，經HRP作用后，40min達到高峰；終止液有多種，疊氮鈉或SDS等酶抑制劑可以維持藍色12-24h不褪色；

OPD受光照會自行變色，要避光，經HRP作用后，37℃孵育20-30min后顏色即不再加深；常用終止液為2MH2S04；

第27頁/共42頁HRP的色原底物系統(tǒng)

與HRP反應后的顏色加終止液后的顏色讀數(shù)波長特點OPD臨苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基聯(lián)苯胺450nm操作方便，本底較高第28頁/共42頁ELISA數(shù)據的處理根據standard的濃度和對應的OD值計算出線性方程將所測定樣品的OD值代入方程計算出相應的樣品的濃度第29頁/共42頁Protocal包被：用Coatingbuffer

1:1000稀釋CaptureAb，100ul/孔，濕盒4℃過夜；洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，3×3min，控干；封閉：加1×Assaydiluent200ul/孔，37℃避光孵育2h；洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，4×3min，控干；5.加樣：100ul/孔，37℃避光孵育1h；6.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100ul/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP:用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100ul/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，5×3min，控干；11.顯色：1×TMBsolution，100ul/孔，37℃孵育1-30min；12.終止反應：顯色完全后加2MH2SO450ul/孔，終止顯色反應；于450nm處讀取光密度OD值或吸光度A值；13.繪制標準曲線，分析數(shù)據第30頁/共42頁2.洗滌

次日，棄去孔內液體，用0.05%PBST洗板3次（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去），控干，洗去游離抗體。濕盒中，4℃過夜酶標板1.包被(NotePBST洗滌液:0.05%Tween-20-PH7.41×PBS)

1×Coatingbuffer1:1000稀釋CaptureAb，

100μl/孔加入到酶標板中，封口膜(或保鮮膜等）封閉酶標板后，放入濕盒中，4℃過夜。

第31頁/共42頁

1×Assaydiluent，200μl/孔加入到酶標板中，封口膜封閉酶標板后，放入濕盒中，37℃避光孵育2h。4.洗滌

棄去孔內液體，用0.05%PBST洗板4次，（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去）；控干；37℃避光孵育2h3.封閉（Note1×Assaydiluent：用純水將5×Assaydiluent稀釋至1×）

以上助教老師負責完成第32頁/共42頁5.加樣----抗原與抗體孵育

1）制作標準曲線：

1×Assaydiluent倍比稀釋standard，每個梯度各取100μl加入酶標板，做復孔；

2）待測樣品：取100μl待測樣品加入酶標板，做復孔；

3）空白對照：取100μl1×Assaydiluent加入酶標板，做復孔；37℃避光孵育1h50ulStandard原液?

?

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1/161/32第33頁/共42頁待測抗原100μl空白對照陽性對照每組4位同學的加樣順序：待測抗原100μl待測抗原100μl樣本有4種，每人選一種做復孔每組做陽參2個孔每組做空白對照2個孔（加樣1×Assaybuffer）每孔加樣100μl待測抗原100μl第34頁/共42頁6.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:

用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100μl/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP(HRP見光分解，之后所有步驟避光操作）用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100μl/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內液體，PBST洗滌，5×3min，控干；第35頁/共42頁11.顯色：1×TMBsolution，100μl/孔，37℃孵育