結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷（全省定點(diǎn)門診醫(yī)生培訓(xùn)班.6）1 結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院門診醫(yī)生規(guī)范化診治培訓(xùn)班課件

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷柳正衛(wèi)浙江省疾病預(yù)防控制中心1結(jié)核病防治臨床診治實(shí)驗(yàn)檢測隨訪督導(dǎo)藥品供應(yīng)23結(jié)核病診治中最困擾您的是什么？我能給臨床提供哪些檢測結(jié)果呢？我需要哪些檢測來輔助我的診治呢？45臨床醫(yī)生患者實(shí)驗(yàn)室提供的信息越充分，越能配合治療提供的信息越充分，診治的效果越明顯提供的信息越充分，實(shí)驗(yàn)室檢測針對(duì)性更強(qiáng)6檢測報(bào)告大多數(shù)是基于體外檢測的結(jié)果對(duì)一份檢測報(bào)告，應(yīng)結(jié)合具體情況綜合判斷臨床也應(yīng)掌握檢測的原理與結(jié)果的意義，便于診治和有疑義時(shí)的解釋工作臨床也應(yīng)關(guān)注實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制體系7結(jié)核分枝桿菌電子顯微鏡下結(jié)構(gòu)89一條結(jié)核桿菌在體內(nèi)的繁殖情況天數(shù)結(jié)核桿菌數(shù)天數(shù)結(jié)核桿菌數(shù)天數(shù)結(jié)核桿菌數(shù)1295121713107224101024182621443811204819524288416124096201048576532138192212097152664141638428268416×103712815327683534535×10682561665536424396800×10610萋尼氏染色涂片鏡檢固體羅氏培養(yǎng)普通PCR擴(kuò)增檢測別離培養(yǎng)涂片鏡檢分子診斷肺結(jié)核診斷熒光染色涂片鏡檢液體培養(yǎng)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測恒溫?cái)U(kuò)增檢測金胺O染色AFB(×40物鏡)金胺O染色AFB(×20物鏡)抗酸桿菌(acid-fastbacilli，AFB)鏡檢11LED顯微鏡12感染性肺結(jié)核病人的特征5,000bacilli/1mL:涂片陽性10,000bacilli/1mL:95%可能陽性痰涂片陽性的病人是主要的傳染源痰涂片陰性的病人15~20%具有傳染性13抗酸菌數(shù)量與鏡檢陰性幾率比較CFU/ml痰標(biāo)本直接涂片(－)幾率150088.5300081.31500019.63000017.31500001.63000000---Mundy14留痰次數(shù)對(duì)痰檢陽性的關(guān)系即時(shí)痰；晨痰；夜間痰；1998年Nelson等報(bào)道：采用229位患者不同時(shí)間采集的干酪樣和粘液樣痰標(biāo)本，進(jìn)行AFB鏡檢，雖然清晨痰的陽性率最高(47.0％)，即時(shí)痰的陽性率最低(41.7％)，但結(jié)果在臨床診斷的符合率和可靠性上均無顯著性差異。15Threesputumsmearsareoptimal16不同痰液涂片陽性率表

〔僅供例如〕

性質(zhì) 例數(shù) 陽性數(shù) 陽性率

干酪樣痰 55 36 65.5%

血性痰 46 16 34.8%

粘液性痰 529 56 10.6%

水樣痰 92 7 7.6%

1718痰涂片檢查登記本

實(shí)驗(yàn)序號(hào)日期姓名性別年齡痰標(biāo)本來源標(biāo)本鏡檢結(jié)果簽名備注初診患者(門診序號(hào))隨訪患者(患者登記號(hào))標(biāo)本性狀結(jié)果日期實(shí)驗(yàn)室流水號(hào)

********090031A陰性

**外單位送檢標(biāo)本請(qǐng)注明來源及就診者相關(guān)信息，以便追蹤。

2B3C數(shù)字+

09002********083201D**2319分枝桿菌別離培養(yǎng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢查是目前結(jié)核病診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)〞，如病人標(biāo)本中檢出結(jié)核菌，可100%確診為結(jié)核病，并且具有傳染性。理論上可檢出一條菌，實(shí)際工作中只有約1/3肺結(jié)核病人為陽性；且用時(shí)較長，需4~8周左右；無法鑒定結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌。靈敏度略高于涂片，可以鑒定死菌與活菌，可進(jìn)一步做菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，為結(jié)核病流行病學(xué)及臨床治療提供用藥依據(jù)。20液體培養(yǎng)基營養(yǎng)好，細(xì)菌生長快，利于快速診斷。米氏7H9液體培養(yǎng)基液體變色培養(yǎng)基底層有顆粒狀沉淀，上清無色透明顯色劑：四唑鎓鹽→復(fù)原成粉紅色甲臢21

結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)儀檢測BACTECMGIT960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀BacT/ALERT3D全自動(dòng)培養(yǎng)儀熒光物質(zhì)包埋在7H9液體培養(yǎng)管的底部，分枝桿菌生長過程中，O2被消耗，底物產(chǎn)生熒光，儀器通過測定熒光強(qiáng)度，用生長指數(shù)來表示測定結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)間通常需要7~42天。分枝桿菌生長過程中代謝產(chǎn)生CO2，CO2的產(chǎn)生使瓶底顏色感受器產(chǎn)生不同的顏色變化。通過比色傳感器來測定，CO2產(chǎn)生的速率和總量與細(xì)菌生長的速率和總量一致。22BACTECMGIT分枝桿菌熒光判讀器23分子生物學(xué)診斷利用分子生物技術(shù)作為結(jié)核菌快速檢測、分型、抗藥性菌株檢測及測定突變，是不可阻擋之趨勢，但現(xiàn)階段仍無法取代傳統(tǒng)之涂片抗酸性染色及培養(yǎng)，特別是藥物敏感性試驗(yàn)。24PCR檢測診斷條件臨床上若痰涂片為陽性，其敏感度為80%至95%，特異度90%至98%，相反地若涂片陰性但培養(yǎng)陽性時(shí)，其敏感度為48%至53%，但特異度仍維持在95%，現(xiàn)有之資料顯示臨床醫(yī)師在決定是否要以PCR作診斷時(shí)，必須按病人之臨床表現(xiàn)而定，但仍無法取代傳統(tǒng)之培養(yǎng)。25核酸擴(kuò)增檢測〔NAA〕檢測規(guī)定一般收集三個(gè)不同的采集日期的標(biāo)本，并分別做涂片染色鏡檢及結(jié)核菌培養(yǎng)。取第一個(gè)涂片鏡檢呈陽性的檢體進(jìn)行NAA；如果有需要，那么再收集另一套檢體做確認(rèn)。如果第一套檢體涂片鏡檢及NAA檢查皆呈陽性，那么可推斷為結(jié)核感染。若涂片染色呈現(xiàn)陽性，但是NAA檢查呈陰性，那么必須檢查是否因PCR反響中含有核酸復(fù)製的抑制物所引起。若無抑制物的影響，且重復(fù)另一套檢體的結(jié)果亦呈陰性，那么可推測病人可能感染非結(jié)核分枝桿菌〔NTM〕若涂片染色呈陰性，但NAA檢查呈陽性的情形，那么必須再做另一套檢體，如果得到相同結(jié)果，那么可推論此病人極可能感染結(jié)核病。如果兩者皆為陰性，那么表示這個(gè)病人并沒有結(jié)核病感染。然而，單靠NAA結(jié)果并不能將病人為活動(dòng)性結(jié)核的可能性完全排除，最后診斷仍需要仔細(xì)評(píng)估臨床癥狀的嚴(yán)重度與感染結(jié)核病的可能性，以及是否接受藥物治療等因素考慮進(jìn)去。尤其是當(dāng)分子檢驗(yàn)結(jié)果與臨床癥狀不一致時(shí)，病人的臨床病情是否高度疑心結(jié)核感染是判讀NAA結(jié)果與決定后續(xù)處置的重要依據(jù)。26LAMP試驗(yàn)檢測結(jié)果圖：綠色為陽性橙色為陰性

27改進(jìn)羅氏比例法線性探針檢測基于液體的藥敏檢測傳統(tǒng)藥敏檢測耐藥基因突變檢測耐藥性檢測液體培養(yǎng)基因芯片檢測藥物MIC檢測28改進(jìn)羅氏比例法2930計(jì)算耐藥百分比：含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)耐藥百分比=--------------------------×100%對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)假設(shè)耐藥百分比大于或等于1%，那么認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

BBLMGIT液體藥敏試驗(yàn)31INH:耐藥Day7RIFDay5GCDay7INHRIF:敏感結(jié)果判讀3233時(shí)間比較樣本選擇方式對(duì)照管報(bào)陽時(shí)間最終確認(rèn)時(shí)間直接培養(yǎng)（10）3-5天5-7天次培養(yǎng)（15）7-13天9-13天液體培養(yǎng)比例法28天液體培養(yǎng)時(shí)間跨度GenoType?MTBDRplus

檢測程序1)從用NALC/NaOH處理的痰取DNA2)PCR擴(kuò)增3)雜交對(duì)擴(kuò)增的特異DNA核酸進(jìn)行反向雜交，探測鏈上的堿基對(duì)4)評(píng)價(jià)4)評(píng)價(jià)34GenoType?

MTBDRplus

利福平耐藥：rpoB基因rpoB野生型-探針:WT1到WT8rpoB突變探針:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通過缺失的野生型信號(hào)進(jìn)行突變探測→通過出現(xiàn)的突變信號(hào)進(jìn)行突變探測35分枝桿菌復(fù)合群中的耐藥基因檢測原理3637雜交試劑38

結(jié)果判讀與解釋39

結(jié)果判讀與解釋40快速耐藥檢測DNA微陣列芯片法414243快速耐藥檢測DNA微陣列芯片法第3次耐藥監(jiān)測MDR菌株的局部檢測結(jié)果rpoB基因突變〔516G-T〕inhA基因突變〔-15C-T〕KatG基因突變〔315G-C〕44快速耐藥檢測-DNA微陣列芯片法目前國家參比室已發(fā)布了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程45結(jié)核分枝桿菌鑒定程序46分枝桿菌菌種鑒定的意義非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率在不同的國家、不同的地區(qū)報(bào)告差異很大。據(jù)資料報(bào)道，日本在1980年報(bào)告：在分枝桿菌感染中，非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率為12%，并有逐年上升趨勢，其中主要為鳥胞內(nèi)復(fù)合群，高達(dá)89.6%，其次為堪薩斯占8.0%我國2007年耐藥基線調(diào)查結(jié)果顯示，我國的非結(jié)核分枝桿菌大約為3.04%。我省第3次耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，我省的非結(jié)核分枝桿菌大約為3.47%4748分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性低于結(jié)核菌，但各型和各菌株之間對(duì)藥物的敏感性差異甚大。分枝桿菌的主要類型分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群非結(jié)核分枝桿菌(MTC)(NTM)麻風(fēng)分枝桿菌〔M.leprae〕49分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是非結(jié)核分枝桿菌，也是進(jìn)一步菌種鑒定的根底。分枝桿菌臨床別離株藥物敏感性試驗(yàn)應(yīng)與菌種初步鑒定同步進(jìn)行，以對(duì)硝基苯甲酸〔PNB〕、噻吩-2-羧酸肼〔TCH〕鑒別培養(yǎng)基初步鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基的制備過程略。50分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗(yàn)牛分枝桿菌——————結(jié)核分枝桿菌—+————NTM++++++51結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群〔MTC〕鑒定方法該方法可以鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和Ⅱ型、牛分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、caprae分枝桿菌以及canettii分枝桿菌。52非結(jié)核分枝桿菌〔nontuberculosismycobacteria，NTM〕是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌的總稱。53NTM迄今為止已發(fā)現(xiàn)有150余種,目前已證實(shí)50多種具有潛在致病性。分類習(xí)慣上仍采用Runyon分類法——根據(jù)菌落色素﹑生長速度分為四組54NTM非結(jié)核分枝桿菌〔nontuberculous

mycobacteria,NTM〕是指分枝桿菌屬中除結(jié)核分枝桿菌及麻風(fēng)分枝桿菌以外的一組分枝桿菌可導(dǎo)致慢性肺部疾病、淋巴結(jié)炎、皮膚和軟組織感染及全身播散型NTM病等。NTM屬于時(shí)機(jī)性致病菌，它的致病性和毒力均較結(jié)核桿菌低。NTM對(duì)現(xiàn)有抗結(jié)核藥物大多耐藥，所以NTM病治療困難，預(yù)后不佳。55結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的主要區(qū)別

區(qū)別點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌菌落外形粗糙、顆粒、結(jié)節(jié)滑或粗糙菌落色澤乳酪色黃或橘紅色抵抗力對(duì)酸堿有一定抗力對(duì)酸堿較敏感生長溫度較嚴(yán)格，370C最正確范圍較寬25~400C生長速度慢4~8周快〔1周內(nèi))慢2~4周感染途徑呼吸、消化道接觸感染致病性致病菌多為條件致病菌所致疾病人和動(dòng)物結(jié)核病各部位NTM病治療對(duì)抗癆藥敏感常耐抗癆藥物

56大量研究以及臨床治療病例說明多數(shù)傳統(tǒng)抗TB藥對(duì)NTM病很少或沒有活性，所以NTM病治療困難，預(yù)后欠佳。57NTM醫(yī)院感染的爆發(fā)流行醫(yī)院內(nèi)感染系指在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染，其發(fā)病可以在住院期間，也可以在出院后，可以是散在發(fā)生，也可以是爆發(fā)流行。58非結(jié)核分支桿菌醫(yī)院感染的爆發(fā)流行NTM作為醫(yī)源性感染或醫(yī)院感染病原體的報(bào)道那么始于1973年自70年代中期至1996年國外文獻(xiàn)至少有25起NTM醫(yī)院感染爆發(fā)事件，病例數(shù)600以上，每起3～298例不等，均屬快速生長NTM，尤以龜分支桿菌及膿腫分支桿菌更常見。1996年中國臺(tái)灣報(bào)道3年期間22例快速生長分支桿菌〔龜分支桿菌19例、偶然分支桿菌3例〕角膜炎，深圳膿腫分支桿菌引起的醫(yī)院感染爆發(fā)事件，59NTM醫(yī)院感染爆發(fā)流行事件

深圳市于1998年4~6月發(fā)生一起膿種分枝桿菌引起的院內(nèi)術(shù)后感染爆發(fā)流行事件。該院在4~6月期間共做手術(shù)292例，其中168人發(fā)生手術(shù)切口感染，感染率為57.5%，為國內(nèi)