第五章核酸序列分析

第五章核酸序列分析核酸序列分析是生物信息學(xué)一個(gè)重要應(yīng)用方面,所有從事分子生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室都要對(duì)獲得的核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，這已經(jīng)成為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)之前的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)操作。很多時(shí)候通過(guò)簡(jiǎn)單序列相似性比較就可對(duì)未知序列進(jìn)行初步功能預(yù)測(cè)，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)方向及策略。AnalysismethodsDatagenerationplatformsComputingpowerDNA序列分析可大體分為兩類：（1）測(cè)序DNA序列分析（2）特定DNA序列分析。包括：DNA堿基組成、密碼子偏向性、內(nèi)部重復(fù)序列、酶切位點(diǎn)、編碼區(qū)分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等，但不局限于這些內(nèi)容。進(jìn)行序列分析也需要一些工具，這些工具包括在線工具和本地化工具。在線工具資源可以通過(guò)看資料、讀相關(guān)文章獲得（如前面提到的“核酸研究”上的在線服務(wù)專輯），也可以利用搜索工具(google等)到網(wǎng)上搜尋或到論壇詢問(wèn)。本地化工具有免費(fèi)的也有收費(fèi)的，免費(fèi)的一般可以從網(wǎng)上下載。其中，收錄、介紹了大量生物軟件及生物軟件的使用方法，同時(shí)還有一些在線分析工具。contents1.核酸序列檢索2.分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布、序列轉(zhuǎn)換、核酸序列基本分析3.限制性酶切分析4.克隆測(cè)序分析5.測(cè)序中載體序列的識(shí)別與去除6.核酸序列拼接7.核酸序列的電子延伸8.開(kāi)放閱讀框（ORF）分析9.基因組序列編碼區(qū)/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析10.CpG島分析11.cDNA和GenomicDNA比對(duì)12.基因啟動(dòng)子分析？設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，研究在不同濃度NaCl鹽脅迫下玉米根中SOD2（SuperoxideDismutase2）基因的表達(dá)情況，說(shuō)出具體的實(shí)施方案。（玉米SOD2基因序列已知，手頭有玉米的種子）1.克隆測(cè)序分析克隆測(cè)序分析是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)日常操作之一，一般情況下單次測(cè)序?qū)a(chǎn)生300-500bp的序列，或800-900bp的序列。將測(cè)序峰圖識(shí)別為序列的過(guò)程稱為堿基讀出（basecalling）。送交專業(yè)公司進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果返回后需要對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行一系列后續(xù)分析，如測(cè)序峰圖的查看和載體序列的去除及序列裝配等過(guò)程。當(dāng)然，服務(wù)較好的測(cè)序公司后續(xù)工作做的也較好。一般地，單次測(cè)序的正確率在500bp左右。測(cè)序峰圖查看為了核實(shí)測(cè)序的準(zhǔn)確性，往往需要對(duì)測(cè)序峰文件進(jìn)行直接分析。Windows環(huán)境下最簡(jiǎn)單的峰圖查看程序是澳大利亞的Chromas.exe程序，這是一個(gè)專業(yè)程序，運(yùn)行快、操作簡(jiǎn)單。其它的軟件還有BioEdit和DNAMAN等也都具有該功能。Chromas.exe查看測(cè)序峰圖打開(kāi).ab1文件。開(kāi)始一段序列的信號(hào)很雜亂，幾乎難以辨別，主要是因?yàn)闅埓娴娜玖蠁误w造成的干擾峰所致。該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測(cè)序電泳開(kāi)始階段電壓有一個(gè)穩(wěn)定期，所以經(jīng)常有20-50bp

的緊接著引物的片段讀不清楚，有時(shí)甚至更長(zhǎng)?？奢敵鰹?txt的文本格式文件。DNAMAN查看測(cè)序峰圖調(diào)節(jié)按鈕導(dǎo)出序列測(cè)序峰圖導(dǎo)出的文本再“載入序列”→“選定項(xiàng)目”后就可以直接載入軟件中分析！Bioedit查看測(cè)序峰圖調(diào)節(jié)按鈕選擇“copyFastaformatted”，相當(dāng)于將文件中的序列以Fasta格式復(fù)制，可黏貼到記事本中。2.測(cè)序中載體序列的識(shí)別與去除許多數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了常用的測(cè)序載體序列，使用Blast程序?qū)Υ祟悢?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析即可得知目的序列中是否含有載體序列。如果是，在對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析之前必須將載體序列去除。此過(guò)程雖然很簡(jiǎn)單，在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中仍然有一些序列含有載體序列污染。

NCBI的載體識(shí)別程序/VecScreen/VecScreen.html

EMBL的載體識(shí)別程序http://www.ebi.ac.uk/blastall/vectors.htmlNCBI中載體分析服務(wù)網(wǎng)頁(yè)截圖輸入序列發(fā)現(xiàn)載體序列EMBL中載體分析服務(wù)網(wǎng)頁(yè)截圖結(jié)果3.核酸序列拼接通過(guò)2個(gè)及2個(gè)以上測(cè)序反應(yīng)獲得的序列都要拼接成一個(gè)完整的序列，實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模測(cè)序獲得的各序列可以通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)軟件非常容易地拼接到一起，形成一條完整的序列，也即形成一條contig。這類軟件包括：DNAMAN、DNASTAR、Genetool等。以DNAMAN軟件為例：序列拼接待拼接序列顯示區(qū)某次測(cè)序的結(jié)果有兩個(gè)序列，將其拼成一條。拼接結(jié)果導(dǎo)出的是拼接后的序列序列拼接在線服務(wù)核酸在線拼接軟件：CAP3（contigassemblyprogram）http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php可以自己以關(guān)鍵詞搜索，還有其他軟件。序列拼接在線服務(wù)粘貼序列結(jié)果鏈接結(jié)果核酸序列的分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布等分析可以通過(guò)一些常用軟件如：DNAMAN、Genetool、DNAStar等進(jìn)行。下面我們以小鼠SOD1基因?yàn)槔?，利用DNAMAN軟件進(jìn)行上述分析。4.分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布、序列轉(zhuǎn)換酸序列基本分析以DNAMAN軟件為例打開(kāi)序列展示序列：Sequence---DisplaySequence進(jìn)行序列分析時(shí)，經(jīng)常需要對(duì)DNA序列進(jìn)行各種變換，如反向序列、互補(bǔ)序列、互補(bǔ)反向序列、顯示DNA雙鏈、轉(zhuǎn)換為RNA序列等。得到的結(jié)果序列基本信息具體序列顯示轉(zhuǎn)換后的不同序列？設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)什么樣的方法獲得家蠶性信息素結(jié)合蛋白（CSP1）在家蠶不同組織（頭、胸、腹、觸角、翅、足）中的表達(dá)譜，說(shuō)出具體的實(shí)施方案。（家蠶CSP1基因可以查到，手頭上有家蠶的個(gè)體）5.限制性酶切分析限制型酶切分析是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中日常工作之一。限制酶數(shù)據(jù)庫(kù)提供了較全面的限制酶相關(guān)信息地址為：/rebase/rebase.html大多數(shù)分子生物學(xué)軟件都具有限制性酶切分析功能，完全可以輕松地實(shí)現(xiàn)限制性酶切分析功能，這方面的軟件如：DNAMAN、Bioedit、DNAStar軟件包等。限制酶數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)頁(yè)截圖輸入內(nèi)切酶的名稱，可查詢其識(shí)別序列及酶切位點(diǎn)以DNAMAN為例載入序列目標(biāo)DNA默認(rèn)為線狀，若選擇“環(huán)狀”，則出現(xiàn)的酶切圖譜為環(huán)狀。在“酶文件”、“全選”、“長(zhǎng)度”及“末端”等選項(xiàng)的選擇都完成后→“完成”?？蛇x“DNase”或“DNA內(nèi)切酶”選擇酶甲基化情況分析結(jié)果以線狀圖示酶切位點(diǎn)以環(huán)狀圖示酶切位點(diǎn)每種酶的單酶切電泳模擬圖2.以BioEdit軟件為例堿基組成序列轉(zhuǎn)換ORF的查找翻譯成相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶的識(shí)別參數(shù)選擇區(qū)顯示序列中的酶切位點(diǎn)顯示內(nèi)切酶識(shí)別的位置顯示序列中不存在的內(nèi)切酶？對(duì)于基因組未進(jìn)行測(cè)序的物種，只知道某一基因的partialCDS區(qū)，如何獲得其全長(zhǎng)cDNA序列？隨著各基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，很多實(shí)驗(yàn)室采用cDNA文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序策略獲得了大量表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTag，EST）和較長(zhǎng)的cDNA序列。但在大多數(shù)情況下，全長(zhǎng)cDNA的獲得嚴(yán)重制約著新基因發(fā)現(xiàn)。同時(shí)很多實(shí)驗(yàn)室采用差異顯示PCR(differentdisplayPCR,DD-PCR)、代表性差異分析（representationaldifferenceanalysis,RDA）等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新基因片斷，但同樣面臨全長(zhǎng)cDNA序列難以獲得的問(wèn)題。6.核酸序列的電子延伸通過(guò)RACE實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行Ы鉀Q全長(zhǎng)cDNA問(wèn)題,但此實(shí)驗(yàn)操作要求高，具有耗時(shí)、耗財(cái)、耗力等缺點(diǎn)。生物信息學(xué)領(lǐng)域的電子延伸、電子克隆技術(shù)為解決全長(zhǎng)cDNA問(wèn)題在理論上提供了捷徑!電子克隆也稱為虛擬克?。╲irtualcloning）原理：根據(jù)大量EST具有相互重疊的性質(zhì)，通過(guò)計(jì)算機(jī)算法獲得cDNA全長(zhǎng)序列。電子克隆以部分cDNA為起始，和GenBank的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，得到與5’或3’端相似序列的EST，然后以該EST為模板，進(jìn)一步搜索EST數(shù)據(jù)庫(kù)，一直往前延伸，直到找到終止密碼子，得到全長(zhǎng)cDNA。電子克隆在公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank/EMBL）中存在大量的序列表達(dá)標(biāo)簽。http:///dbEST,這些EST序列很有可能和研究者感興趣基因序列相重疊，可能代表同一條cDNA序列。因而從生物信息學(xué)原理出發(fā)，基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列或者較長(zhǎng)cDNA序列對(duì)新獲得的EST序列進(jìn)行電子延伸，就有可能獲得全長(zhǎng)cDNA。電子克隆的原理來(lái)源于大片段測(cè)序拼裝，主要依據(jù)片斷末端的重疊?；具^(guò)程將待分析核酸序列（或蛋白序列，稱為種子序列）用blast軟件搜索GenBank的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇與之具有較高一致性的EST序列（稱匹配序列）。將匹配序列與種子序列裝配產(chǎn)生新生序列，此過(guò)程稱為片斷重疊群分析（ContigAnalysis）。（如果種子序列不是核酸，則不必拼裝新序列）以新生序列作為種子序列重復(fù)上述過(guò)程，直至沒(méi)有新的匹配序列入選，從而生成最后的新生序列，作為對(duì)種子序列的延伸產(chǎn)物。對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行ORF分析，確定cDNA的完整性。需要注意的是，核酸序列電子延伸獲得的序列只具有參考作用，可為后繼的實(shí)驗(yàn)研究提供線索，真正的cDNA序列需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得和驗(yàn)證。核酸序列電子延伸示意圖EST序列種子序列EST數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast分析開(kāi)始獲得匹配序列種子序列與匹配序列組裝無(wú)匹配時(shí)結(jié)束，進(jìn)行ORF分析例：以擬南芥（Arabidopsisthaliana）Cu-ZnSOD的蛋白質(zhì)序列（P24704）為種子序列，電子克隆水稻（rice）的Cu-ZnSOD基因的過(guò)程。（1）采用tblastn程序，用P24704對(duì)水稻ESTdb進(jìn)行比對(duì)，獲得匹配的EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)參數(shù)：應(yīng)選擇non-human，non-mouseESTs（estothers）物種名參數(shù)：寫(xiě)rice或水稻拉丁文得到一致性最高的匹配序列（EST序列）(2)因?yàn)槠ヅ湫蛄袨镋ST序列，因此此時(shí)選擇的程序?yàn)椋篵lastn。再次對(duì)水稻ESTdb進(jìn)行比對(duì)。數(shù)據(jù)庫(kù)參數(shù)：選擇others；物種名參數(shù)：寫(xiě)rice或水稻拉丁文匹配的EST序列(3)將所得序列以Fasta格式保存后，用序列拼接程序拼出一條contig。CAP：contigassemblyprogram提交后的結(jié)果點(diǎn)擊“contigs”，獲得拼裝后的序列。如下圖。(4)以新生的contig序列作為種子序列重復(fù)上述過(guò)程，直至沒(méi)有新的匹配序列入選，從而生成最后的新生序列，作為對(duì)種子序列的延伸產(chǎn)物。接下來(lái)要對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行ORF分析，確定cDNA的完整性。如果提交的序列超過(guò)50kb，則無(wú)法拼裝，需減少序列7.開(kāi)放閱讀框（ORF）分析mRNA序列需要翻譯為蛋白質(zhì)才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，因此核酸序列的可讀框架（OpenReadingFrame，ORF）分析也是核酸序列分析一個(gè)重要方面。對(duì)真核生物而言，一條全長(zhǎng)cDNA序列將只含有單一的開(kāi)放閱讀框。非全長(zhǎng)cDNA序列如ESTs，通過(guò)所有位相搜索也可很快獲得結(jié)果。GenBank的ORFFinder是一個(gè)較好的ORF分析網(wǎng)絡(luò)資源。地址：/gorf/gorf.html可以在NCBI首頁(yè)的右邊一欄中直接點(diǎn)擊ORFFinder鏈接進(jìn)入ORF分析頁(yè)面。(1)NCBIORFFinder在線確定ORF粘貼序列序列ID號(hào)或接受號(hào)分析范圍遺傳密碼查看結(jié)果可點(diǎn)擊詳細(xì)查看單擊，詳細(xì)查看一個(gè)ORF。進(jìn)一步確定ORF是否正確需要借助Kozak規(guī)則?？芍苯硬榭此贠RF對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)Kozak規(guī)則所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律。若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，不見(jiàn)得必須全部滿足，一般來(lái)說(shuō)，滿足前兩項(xiàng)即可。Kozak規(guī)則可以幫助確定ORF的起始密碼子。加尾信號(hào)須自行搜索。接著查看其他ORF(2)本地化軟件進(jìn)行ORF分析前提是已經(jīng)loadsequenceORF的查找要求ORF的查找結(jié)果，需要認(rèn)真判斷要那個(gè)ORF序列上載后，也可以在這里進(jìn)行分析圖示ORF分析結(jié)果設(shè)置ORF分析參數(shù)雙擊圖示中的ORF則顯示該ORF的詳細(xì)信息該ORF的詳細(xì)信息8.基因組序列編碼區(qū)/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析真核生物的基因組中內(nèi)含子的分析：真核生物基因組的分析比較麻煩，難于準(zhǔn)確判斷內(nèi)含子和外顯子區(qū)域，也即難于準(zhǔn)確地對(duì)編碼區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。進(jìn)行基因組序列編碼器/內(nèi)含子結(jié)果分析的軟件，如GENSCAN（http:///GENSCAN.html）等。tRNA內(nèi)含子的分析：可以用tRNAscan-SE分析（http:///tRNAscan-SE/）GENSCAN：現(xiàn)有的服務(wù)器設(shè)在MIT，主要應(yīng)用于完整基因的預(yù)測(cè)，包括基因組序列中的外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)位點(diǎn)、供體與受體剪切位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。適用于脊椎動(dòng)物、玉米、擬南芥等不同物種的基因預(yù)測(cè)。適用于脊椎動(dòng)物的版本在被用于果蠅DNA序列的基因預(yù)測(cè)也取得很好的結(jié)果。

GENSCAN是進(jìn)行基因預(yù)測(cè)的首選工具，但存在過(guò)分估算基因數(shù)目問(wèn)題。GENSCAN粘貼序列tRNAscan-SE粘貼序列物種選項(xiàng)9.CpG島分析CpG島：是一些富含GC的小區(qū)域，大小范圍為0.5～5kb，基因中平均每100kb即可出現(xiàn)。因這些區(qū)域未發(fā)生甲基化，故富含CpG(60～70％)，目前認(rèn)為，基因表達(dá)與CpG島甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。CpG島經(jīng)常在脊椎動(dòng)物基因的5’區(qū)域發(fā)現(xiàn)，其中80％的人類基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前存在CpG島。因此相對(duì)于尋找結(jié)構(gòu)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和基因的5’端，CpG島是發(fā)現(xiàn)基因的重要線索，特別是通過(guò)cDNA法難以實(shí)現(xiàn)時(shí)更是如此。http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot粘貼序列

10.cDNA和GenomicDNA比對(duì)對(duì)于已知的cDNA序列及其對(duì)應(yīng)的基因組序列，可以將這兩條序列對(duì)齊以直觀顯示cDNA所編碼基因的結(jié)構(gòu)。Sim4程序即可完成該項(xiàng)工作，分析的結(jié)果可以保存下來(lái)用Lalnview程序在電腦上直觀地顯示。Sim4網(wǎng)址：核酸：http://pbil.univ-lyon1.fr/sim4.php蛋白：http://www.expasy.ch/tools/sim-prot.htmlLalnview下載地址：http://pbil.univ-lyon1.fr/softwar