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----------結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用目的建立結(jié)核分枝桿菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法,探討熒光PCR檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價(jià)值。方法根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針,并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)102例培養(yǎng)涂陽的結(jié)核痰液標(biāo)本和45例非結(jié)核感染者的痰標(biāo)本,應(yīng)用熒光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。結(jié)果熒光定量PCR、抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的特異性分別為100%、30%。結(jié)論熒光定量PCR是一種快速、敏感性高、特異性強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌輔助診斷方法,具有重要的應(yīng)用價(jià)值?!娟P(guān)鍵詞】結(jié)核;分枝桿菌;抗酸染色;熒光定量PCREstablishmentandapplicationoffluorescencequantitativePCRfordetectionofMycobacteriumtuberculosis.ZHUYu-lan,WANGDian-peng,GAOZhao-xian,etal.InternationalTravel AgencyHealthCareCenter, ShenzhenEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen518033,Guangdong,P.R.ChinaAbstract:Objective ToconstituteamethodfordetectionofMycobacteriumtuberculosisbyfluorescencequantitativePCRandevaluatetheapplicationvalueoffluorescencequantitativePCRindetectionofMycobacteriumtuberculosisinsputum. Methods Theprimersandprobeweredesignedandconstitute astandards.The suptumsamplesfrom102tuberculosispatientsand45non-tuberculosispatientsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRandacid-faststain.Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, acid-faststain,were100%and30%respectively. Conclusion FluorescencequantitativePCRisarapidmethodfordiagnosisoftuberculosis,whichshowsahighspecificityandsensitivity.Itisausefultoolfordiagnosisoftuberculosisinthefuture.Key words:Tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; quantitativePCR結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問題之一,自1985急劇上升,據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌,即20億人口感2000800~1000年約有300萬人死于結(jié)核病~3。結(jié)核病已成為導(dǎo)致全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一,活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。據(jù)2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查估計(jì),全國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人450萬,其中傳染性肺結(jié)核病人150[4。結(jié)核病防治是我國(guó)乃至全球疾病防治的重要課題。目前,出入境人員體檢診斷傳染性肺結(jié)核的主要方法是通過胸部X片檢查,加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPDXPPD試驗(yàn)的特異性不強(qiáng),不能作為確診肺結(jié)核PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性達(dá)到100%,本研究以熒光PCR下。材料與方法材料確診肺結(jié)核病人培養(yǎng)涂陽的結(jié)核痰液標(biāo)本102份。正常人的痰液25份,葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標(biāo)本共計(jì)20份。引物與探針根據(jù)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)核桿菌基因序列分析,找出其保守序列,并且在此區(qū)域應(yīng)用Primer5.0和Primerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)引物與探針,探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM標(biāo)記,靠近 3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán) TAMRA標(biāo)記 (表 1)。ForwardPrimer:5’TAGGCGTCGGTGACAAAGGe5;:5。儀器ABI公司的ABI7500熒光Real-timePCR儀。DNA痰液樣品的預(yù)處理吸取待測(cè)痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中,加入5mol/LNaOH500μl,混勻,室溫中搖動(dòng)20min。加入1mol/LNaH2PO4700μl,10000rmp離心5min。TE至102μl濃度為50mg/ml3℃消化30mi。DNA細(xì)胞復(fù)合裂解液置65℃水浴中,使其中的結(jié)晶溶解。將300μl結(jié)晶已溶解的細(xì)胞復(fù)合裂解液加入到上述預(yù)處理好的痰液樣品中2065℃水浴中反應(yīng)20min加入200μl5~616000rmp離心3min16000rmp離心3min,傾去上清。加入200μl70000rmp離心3min。吸去70%乙醇,倒置離心管于干凈的濾紙上,乙醇揮發(fā)完全,加入30μlDNA溶解液,快速漩渦震蕩1~2DNA完全溶解。標(biāo)準(zhǔn)品的制備DNA樣品2μl做為PCR反應(yīng)的模板,加入PCR反應(yīng)液23μl,PCR反應(yīng)液中含有10xPCRBuffer3μl、25mmol/LMgCl21.2μl10mmol/LdNTPs3μl、4U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各,滅菌雙蒸水13.3μl。于PT-200PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行如下循環(huán):先94℃預(yù)變性4min;然后94℃℃?zhèn)€循環(huán);最后72℃延伸10minPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳,凝膠回收試劑盒回收PCR電泳產(chǎn)物,與線性化后的pMD18-T載體(Invitrogen公司℃下連接12~16h,連接反應(yīng)體系中含有PCR凝膠回收產(chǎn)物5μlpMD18-T載體1μl和T4連接酶物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ,轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素抗性的1.5%瓊脂固體LB12~16h,用滅菌牙簽挑取單克隆,接種于含50mg/ml氨芐青霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中,搖床371.6ml經(jīng)PCR初步鑒定,對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析,將篩選出的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增,抽提質(zhì)粒DNA4次,每次重復(fù)4管,取均值),并進(jìn)行10倍系列稀釋,得到濃度分別為108107106105copies/ml的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品,即為陽性定量Taq-manPCR及反應(yīng)條件反應(yīng)液總體系為20μl,每份反應(yīng)液中含有2×Probe-PCRMasterMix)各0.5μl(10μmol/μl)0.2μl,滅菌水6.8μl,結(jié)核桿菌陽性DNA樣品2μl。反應(yīng)條件為:95℃15min(×1),10s→60℃20s→72℃30s(×40)。按照上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,隨著PCR坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)的定量曲線和以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。瓊脂糖凝膠電泳,測(cè)序?qū)崟r(shí)PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓100V,時(shí)間1h。ABI3130基因分析儀序列分析。特異性實(shí)驗(yàn)分別用陰性痰標(biāo)本提取物25份和金黃色葡萄球菌DNA提取物、肺炎鏈球菌DNA提取物、肺炎克雷伯桿菌DNA提取物共20份為對(duì)照模板進(jìn)行Taq-man探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)對(duì)陽性樣本以10倍梯度進(jìn)行稀釋,共5個(gè)稀釋度,最大稀釋倍數(shù)為10萬倍,然后以各稀釋液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)107標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定4組10倍倍比稀釋陽性DNA五次,分別統(tǒng)計(jì)其Ct值。靈敏度實(shí)驗(yàn)對(duì)102例痰液標(biāo)本分別進(jìn)行抗酸染色顯微鏡檢測(cè)和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果定量曲線各個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)陽性株在第一個(gè)循環(huán)結(jié)束后測(cè)到一個(gè)基礎(chǔ)吸光值,接下來一直到第20個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)都沒有明顯變化。從第23個(gè)循環(huán)(Ct36個(gè)循環(huán)前后達(dá)到峰值,隨后進(jìn)入平臺(tái)期,一直到反應(yīng)結(jié)束。陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果痰液DNA進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對(duì)所獲取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,序列分析顯示該產(chǎn)物為TB核酸序列。特異性實(shí)驗(yàn)葡萄球菌等呼吸道易感菌的DNA提取物為對(duì)照模板進(jìn)行Taq-man探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR未檢測(cè)到無熒光信號(hào)。檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)10Taq-man探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè),熒光信號(hào)隨樣本濃度下降而下降,線性范圍為10~107copies/ll重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定410Ct平均值分別是,標(biāo)準(zhǔn)差分別是,變異系數(shù)分別是3.94.3%、1.66.9%,隨著標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的降低,Ct值增大,標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)也呈逐漸增大的趨勢(shì)。2.6靈敏度實(shí)驗(yàn)對(duì)確診肺結(jié)核病人102例痰液標(biāo)本分別進(jìn)行直接涂片染色法和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。直接涂片染色法檢測(cè)靈敏度為30%。熒光PCR檢測(cè)靈敏度為100%。討論肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室快速診斷對(duì)出入境人員傳染性肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)有重要的意義,目前,肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查。細(xì)菌學(xué)檢查是目前傳染性肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)145~8BACTEC是采用放射性同位素技術(shù)對(duì)結(jié)核菌進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)的儀器,使培養(yǎng)分枝桿菌可以把培養(yǎng)時(shí)間大大縮短,需9~14d。分枝桿菌生長(zhǎng)指示管)使用熒光計(jì)量技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌的生長(zhǎng),無污染,陽性率高15,1是快速培養(yǎng)的主流。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌是臨床結(jié)核病診斷的主要依據(jù)方法為直接涂片法和培養(yǎng)法20,但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能鑒別抗酸菌驗(yàn)中102例標(biāo)本實(shí)時(shí)PCR陽性102例(102%),而直接涂片法只有30例(30%)。實(shí)時(shí)PCR法與抗酸染色法比較符合率為100PCRPCRPCR檢測(cè)原理為TaqMan探針法,是在反應(yīng)體系中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針,探針的5′端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM,3′端標(biāo)以熒光猝滅基團(tuán)TAMRAPCR過程中,利用Taq酶的5′→3′外切核酸PCR采用閉管操作,克服了常規(guī)PCR的污染問題,使其具有很高的特異性。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)盡管有少數(shù)假陽性的結(jié)果,但其與常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法互補(bǔ)使用可提高陽性檢出率,仍不失為靈敏度高、特異性強(qiáng)的結(jié)核病輔助診斷的有效方法之一。本研究結(jié)果顯(30%5×103)~(1×104PCR檢測(cè)法陽性率明顯高于抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法,且特異性為100%,這和熒光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技術(shù)密切相關(guān)。尤其是結(jié)核病患者經(jīng)藥物治療或體內(nèi)出現(xiàn)了細(xì)胞壁缺損的L型細(xì)菌導(dǎo)致分離培養(yǎng)結(jié)果呈陰性時(shí),此方PCR可以做到相對(duì)定量,且定量結(jié)果可以指導(dǎo)臨床用藥和療效評(píng)估。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)核抗酸桿菌DNA每毫或)培養(yǎng)陽性的標(biāo)本實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)為陰性。實(shí)時(shí)PCR是臨床上廣泛應(yīng)用的一種基因定量檢測(cè)供了有力參考6。【參考文獻(xiàn)】LethderWerfMW.PrevalenceoftubercμLousinfectionandincidenceoftubercμLosis:are-assessmentoftheStyblorμLe[J].BμLlWorldHealthOrgan,2008,86(1):20~26.[2o,n,nt.ddetectionofmμLosisinPeruvianchildrenbyuseofaheminestedIS6110polymerasechainreactionassay[J].ClinInfectDis,2003,36:16~23.[3]NegiSS,BasirSF,GuptaS.Comparisonoftheconventionaldiagnosticmodalities,BACTECcμLture
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