結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法建立與應(yīng)用目建立結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR探討熒光PCR檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌應(yīng),并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)102例45,PCR法、痰涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。結(jié)果熒光定量PCR100%、30%。結(jié)論熒光定量PCR是一個(gè)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌含相關(guān)鍵應(yīng)用價(jià)值。【關(guān)鍵詞】結(jié)核;分枝桿菌;抗酸染色;熒光定量PCREstablishment and application of fluorescence quantitative PCR for detection Mycobacteriumtuberculosis.ZHUYu-lan,WANGDian-peng,GAOZhao-xian,etal.InternationalTravel AgencyHealthCareCenter, ShenzhenEntryandExitInspectionQuarantineBureau,Shenzhen518033,Guangdong,P.R.ChinaAbstract:Objective ToconstituteamethodfordetectionofMycobacteriumtuberculosisbyfluorescencequantitativePCRandevaluatetheapplicationvalueoffluorescencequantitativePCRindetectionofMycobacteriumtuberculosisinsputum. Methods Theprimersandprobeweredesignedandconstitute astandards.The suptumsamplesfrom102tuberculosispatientsand45non-tuberculosispatientsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRandacid-faststain.Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, stain,were100%and30%respectively. Conclusion FluorescencequantitativePCRisamethodfordiagnosisoftuberculosis,whichshowsahighspecificityandsensitivity.Itisausefultoolfordiagnosisoftuberculosisinthefuture.Key words: Tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; FluorescencequantitativePCR,自1985年以來結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)急,,1/3,20億人口感染了結(jié),2000萬,800～1000萬,每年約有300萬人死于結(jié)核病1～中國(guó)是全球22,活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。據(jù)結(jié)核病流行病學(xué),現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人450萬,其中傳染性肺結(jié)核病人150萬4。結(jié)核病,出入境人員體檢診療傳染性肺結(jié)核關(guān)鍵方法是經(jīng)過胸部X,加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPD試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)。因?yàn)樾夭縓片是依據(jù)臨,,加上肺結(jié)核與其她肺部疾病在胸片上有相同地方,輕易出現(xiàn)誤診和漏診;痰涂片抗酸染色陽性率低,采樣不合格標(biāo)本陽性率更低,極易出現(xiàn)漏診;而PPD,,這三種檢測(cè)方法組合模式在檢測(cè)肺結(jié),,而少數(shù)肺部疾病或其她部位結(jié)核病人可,,特異性高特點(diǎn)成為結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)研究熱點(diǎn)。中國(guó)外大量研究證實(shí)PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性達(dá)成100％,本研究以熒光PCR,,結(jié)果匯報(bào)以下。材料與方法材料確診肺結(jié)核病人培養(yǎng)涂陽結(jié)核痰液標(biāo)本102份。正常人痰液25份,葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標(biāo)本累計(jì)20份。引物與探針依據(jù)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)核桿菌基因序列分析,找出其保守序列,而且在此區(qū)域應(yīng)用Primer5.0和Primerexpress3.0,5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM標(biāo)識(shí),靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA標(biāo)識(shí)表1)ForwardPrimer:5’ReversePrimer:Probe:CACGTAGGCGAACCCTGCCCA儀器ABI企業(yè)ABI7500熒光Real－timePCR儀。痰液DNA提取痰液樣品預(yù)處理吸收待測(cè)痰液200μl1.5mleppendo,5mol/LNaOH混勻,室溫中1mol/LNaH2PO4700μl,(),10000rmp5min。去上清液,補(bǔ)加TE100μl,混勻,20μl50mg/ml3730min。DNA提取,300μl,20秒,置65。加200μl,5～616000rmp3min500μl),,,混勻后16000rmp離心3min,200μl70,,,16000rmp3min70,,,30μlDNA,快速漩渦1～2秒,使沉淀DNA完全溶解。標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)品包含:陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品。以結(jié)核桿菌陽性DNA2μl做為PCR,加入PCR23μl,PCR反應(yīng)液中含有10xPCRBuffer3μl、25mmol/LMgCl2、10mmol/LdNTPs、4U/μlTaqDNA0.5μl10pmol/L1μl,13.3μl。于PT-200PCR擴(kuò)增:944min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);最終7210min。PCR1.5,凝膠回收試劑盒回收PCR,與線pMD18-T載體（Invitrogen企業(yè)12～16h,連接反應(yīng)體系中含有PCR凝5μlpMD18-T1μlT41μl,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ,轉(zhuǎn)化后細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素抗性1.5％瓊脂固體LB培養(yǎng)基上,3712～16h,,50mg/ml氨芐青霉5mlLB,200rpm37;1.6ml,,經(jīng)PCR,,,抽提質(zhì)粒DNA,用(4次,4管,),10倍系列稀釋,108、107、106、105copies／ml4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品,陰性質(zhì)控品以生理鹽水制備,強(qiáng)陽性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品依據(jù)濃度和拷貝數(shù)以標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)滅菌水稀釋后制得。Taq-man探針實(shí)時(shí)PCR及反應(yīng)條件20μl,2×Probe－PCRMasterMix上、下游引物(10μmol/μl)0.5μl,探針(10μmol/μl)0.2μl,6.8μl,結(jié)核桿菌陽性DNA樣2μl:95℃15min(×1),94℃10s→60℃20s→72℃30s(×40)。根據(jù)上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,伴隨PCR,就得到了以循環(huán)數(shù),Ct曲線。,測(cè)序PCR2,,1hABI3130基因分析儀序列分析。特異性試驗(yàn)25份和金黃色葡萄球菌DNADNADNA20Taq-manPCR檢測(cè)。檢測(cè)限試驗(yàn)對(duì)陽性樣本以10倍梯度進(jìn)行稀釋,共5個(gè)稀釋度,最大稀釋倍數(shù)為10萬倍,然后以各稀釋液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。反復(fù)性試驗(yàn)107410倍倍比稀釋陽性DNA五次分別統(tǒng)計(jì)其Ct值。靈敏度試驗(yàn)對(duì)102例痰液標(biāo)本分別進(jìn)行抗酸染色顯微鏡檢測(cè)和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果定量曲線各個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)陽性株在第一個(gè)循環(huán)結(jié)束后測(cè)到一個(gè)基礎(chǔ)吸光值,接下來一直到第20個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)都沒有顯著改變。從第23,,25(Ct值)后,,36,,一直到反應(yīng)結(jié)束。陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果痰液DNA進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),對(duì)所獲取PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,序列分析顯示該產(chǎn)物為TB核酸序列。特異性試驗(yàn)DNATaq-manPCR檢測(cè)到無熒光信號(hào)。檢測(cè)限試驗(yàn)10,Taq-manPCR檢測(cè),熒光信號(hào)隨樣本濃度下降而下降,線性范圍為103～107copies/ml,檢測(cè)下限為102copies/ml。反復(fù)性試驗(yàn)反復(fù)測(cè)定4組10倍倍比稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品,濃度由高到低Ct平均值分別是21.07、24.6、28.16、31.57,標(biāo)準(zhǔn)差分別是0.69、0.88、0.39、1.82,變異系數(shù)分別是3.9%、4.3%、1.6%、6.9%,伴隨標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)降低,Ct值增大,標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)也呈逐步增大趨勢(shì)。2.6 靈敏度試驗(yàn)對(duì)確診肺結(jié)核病人102例痰液標(biāo)本分別進(jìn)行直接涂片染色法和實(shí)時(shí)PCR30％。熒光PCR100％。討論肺結(jié)核試驗(yàn)室快速診療對(duì)出入境人員傳染性肺結(jié)核發(fā)覺相關(guān)鍵意義,現(xiàn)在,肺結(jié)核試驗(yàn)室診療方法關(guān)鍵有細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)、免疫學(xué)檢驗(yàn)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)是現(xiàn)在傳染性肺結(jié)核診療金標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)出來陽性對(duì)肺結(jié)核診療意義最大,關(guān),痰涂片抗酸染直接鏡檢法陽,陽性率只有14～47%,,陽性率相差很大1。提升痰標(biāo),加強(qiáng)痰涂片鏡檢質(zhì)量控制是現(xiàn)在中國(guó)外研究關(guān)鍵片法,且能得到活菌,但因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)速度太慢,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),傳統(tǒng)方法培養(yǎng)需要5～8BACTEC,使培養(yǎng)分枝桿菌能,9～14d。分枝桿菌生長(zhǎng)指示管使用熒光計(jì)量技術(shù)檢測(cè),,陽性率高［15,16］,,是快速培養(yǎng)主流。試驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌是臨床結(jié)核病診療關(guān)鍵依據(jù)傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵方法為直接涂片法和培養(yǎng)法［20］,但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能判別抗酸菌死活缺點(diǎn),而培養(yǎng)法則存在特異性差和需時(shí)較長(zhǎng)不足［5］,實(shí)際臨床應(yīng)用受限。本試驗(yàn)中102例標(biāo)本實(shí)時(shí)PCR陽性102例(102%),而直接涂片法只有30例(30%)。實(shí)時(shí)PCR法與抗酸染色法比較符合率為實(shí)時(shí)PCR法操作簡(jiǎn)便、快速、高,含有很高敏感性、特異性,且其在密閉體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定,降低了污染可能性,并可正確地進(jìn)行定量檢,為傳染病監(jiān)測(cè)提供參考實(shí)時(shí)PCR技術(shù)尤其對(duì)部分含菌量低標(biāo)(如尿液、胸腹)檢測(cè)含有非常實(shí)用價(jià),大大提升了結(jié)核分枝桿菌檢出率。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)原理為TaqMan探針,是在反應(yīng)體系中加入一個(gè)熒光標(biāo)識(shí)探,探針5′端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM, 3′端標(biāo)以熒光猝滅基團(tuán)。實(shí)時(shí)PCR過程,利用Taq酶5′→3′外切核酸酶活性釋放熒光信號(hào)模板每復(fù)制一,便釋放一個(gè)熒光信,依據(jù)熒光強(qiáng)弱可對(duì)模板進(jìn)行正確定量因?yàn)閷?shí)時(shí)PCR采取閉管操,克服了常規(guī)PCR污染問,使其含有很高特異性。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)盡管有少數(shù)假陽性結(jié),但其與常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法互補(bǔ)使用可提升陽性檢出,仍不失為靈敏度高、特異性強(qiáng)結(jié)核病輔助診療有效方法之一。本研究結(jié)果顯示, 痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率(30%)較低,是可能因?yàn)榭顾崛旧芴抵屑?xì)菌數(shù)量限制,通常最少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)個(gè)細(xì)菌方可得出陽性結(jié),且結(jié)核病人是間斷性排,可能造成假陰性。這就要求我們?cè)诳顾崛旧珪r(shí)要嚴(yán)格控制條件,挑取標(biāo)本中干酪樣或膿性部分,以提升陽性率。而實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)法陽性率顯著高于抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng),且特異性為100%,這和熒光定量PCR原理和它所采取一系列新技術(shù)親密相關(guān)。尤其是結(jié)核病患者經(jīng)藥品診療或體內(nèi)出現(xiàn)了細(xì)胞壁缺損L型細(xì)菌造成分離培養(yǎng)結(jié)果呈陰性時(shí),此方法檢測(cè)結(jié)果仍不受影,PCR,且定量結(jié)PCR檢測(cè)結(jié)核抗酸桿菌DNA細(xì)菌即可取得陽性結(jié)果,而且在本試驗(yàn)建立過程中,無一例抗酸染色陽性和(或)培養(yǎng)陽性標(biāo)本實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)為陰性。實(shí)時(shí)PCR,,為結(jié)核快速診療提供了有力參考6?！緟⒖嘉募浚?］vanLethF,vanderWerfMJ,BorgdorffMW.PrevalenceoftubercμLousinfectionandincidenceoftubercμLosis:are-assessmentoftheStyblorμLe［J