第四章 抗體制藥

第四章抗體制藥第一節(jié)概述

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。

免疫球蛋白是化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念，抗體是生物學(xué)功能上的概念，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都具有抗體活性抗體產(chǎn)生的機(jī)制：

抗原物質(zhì)機(jī)體免疫系統(tǒng)B淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞球蛋白刺激激活分化、增殖分泌20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念。

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進(jìn)行定向治療。McAb的改造1.改造的必要性①單克隆抗體均是鼠源性抗體，直接應(yīng)用于人體易產(chǎn)生人抗鼠免疫反應(yīng)②完整抗體分子的相對分子量過大，難以穿透腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度2.改造方向①降低單克隆抗體的免疫原性②降低單克隆抗體的相對分子量

第二節(jié)單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。

一、抗原與動(dòng)物免疫

制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法：

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg。

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點(diǎn)：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。

體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o

二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的方法：脾細(xì)胞（1×108）骨髓瘤細(xì)胞（2×107）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。

用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)，長期穩(wěn)定。

PEG相對分子量4000，濃度為50%

二甲基亞砜增加融合率。

細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞。選擇性培養(yǎng):

培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻斷DNA合成。

三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。

克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定

雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標(biāo)，了解分泌抗體的能力。單抗進(jìn)行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA鑒定。親和力、特異性、純度、分子量測定五、單克隆抗體的大量制備

體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲的5～20mg/ml抗體

用BALB/c小鼠降植烷接種雜交瘤細(xì)胞取腹水離心上清。六、單克隆抗體的純化

依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。第三節(jié)

基因工程抗體及其制備

雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相對分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。Ig分子結(jié)構(gòu)Ig分子的基因結(jié)構(gòu)二、抗體的結(jié)構(gòu)及基因組成（一）抗體的結(jié)構(gòu)（圖4-4）抗體分子的結(jié)構(gòu)是由二硫鍵連接起來的約4條多肽鏈

N-端區(qū)段

2條H鏈：約450~570個(gè)aa組成C-端區(qū)段

N-端區(qū)段

2條L鏈：約214個(gè)aa組成

C-端區(qū)段

Ig分子aa組成和排列順序多變，稱為可變區(qū)（V區(qū)）aa組成和排列比較恒定，稱為恒定區(qū)（C區(qū)）

1.在V區(qū)，某些特定位置的aa殘基顯示更大的變異性，構(gòu)建了抗體分子和抗原分子發(fā)生特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），抗體能與特定抗原特異性結(jié)合與CDR密切相關(guān)）

2.C區(qū)決定抗體分子的異種抗原性（二）抗體結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結(jié)合功能—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。二、改形抗體（CDR移植抗體）

Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱框架區(qū)。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱浴Ｈ?、小分子抗體

1.結(jié)構(gòu)特征：基因工程的小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子量僅為原抗體的到2.類型：①Fab片段抗體：由完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)加部分恒定區(qū)

②FV抗體：由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成

③單鏈抗體：由VH鏈和VL鏈的CDR通過一段連接肽連接而成的重組蛋白④單域抗體：由H鏈或L鏈的單個(gè)CDR區(qū)組成；分子量只有原抗體，表面疏水性強(qiáng)，與抗原的非特異性結(jié)合能力較強(qiáng)⑤最小識別單位（MRU）：由互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成；也具有與抗原結(jié)合的能力，但親和力極低

1.單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)①可以去除許多造成非特異反應(yīng)的競爭性表面蛋白，腫瘤顯像的背景更清晰②更容易滲透到腫瘤組織中去，增加有效藥物濃度③相對分子量小，所以鼠源性抗體的免疫原性小，能消除人抗鼠的排斥反應(yīng)，延長其在人體內(nèi)的半衰期

2.單鏈抗體在大腸桿菌中表達(dá)①非融合表達(dá)：以游離的形式直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)②融合表達(dá)：與菌體蛋白融合表達(dá)（N-端為E.Coli菌體蛋白，C-端為抗體蛋白）③分泌表達(dá)：與信號肽基因相連接，產(chǎn)物分泌到胞外；具有功能的單鏈抗體單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)與表達(dá)形式第四節(jié)多功能抗體及其制備

雙功能抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年提出。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

雙功能抗體（研制階段）雙功能抗體（研制階段）1.概念：又稱為雙特異性抗體（BsAb），是由人工構(gòu)建的，具有同時(shí)與兩種抗原特異結(jié)合的雙臂抗體2.雙功能抗體的優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)臂識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，包括腫瘤相關(guān)抗原、癌基因產(chǎn)物、特殊的白細(xì)胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特異性受體等，并有效結(jié)合；另一個(gè)臂可識別免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子，如CD3、毒素、藥物等，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞或毒素與藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用。即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。雙功能抗體在治療腫瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病中將會(huì)產(chǎn)生巨大的應(yīng)用價(jià)值。（1）化學(xué)交聯(lián)法：將兩個(gè)抗體交聯(lián)在一起，此法快速、簡便、高效，純化簡單；但此法構(gòu)建的雙功能抗體，可能由于化學(xué)交聯(lián)過程會(huì)影響抗體的功能，不太容易達(dá)到靶部位，體內(nèi)穩(wěn)定性較差，且無連續(xù)性等

3.構(gòu)建方法（2）生物學(xué)方法（雜種-雜交瘤法）：將普通抗體產(chǎn)生細(xì)胞（脾細(xì)胞）與產(chǎn)生McAb的雜交瘤細(xì)胞融合而成；此法連續(xù)性好，但構(gòu)建過程復(fù)雜、周期長、純化技術(shù)復(fù)雜，基因組過大且不穩(wěn)定，又不能對雙功能抗體進(jìn)行改造。故不常用

（3）基因工程法：1993年由Holligen等人首次構(gòu)建而成，即用人工接頭連接不同抗體的VH和VL，以融合蛋白的形式表達(dá)非共價(jià)鍵二聚體VHA-肽-VLBVLA-肽-VHB共價(jià)連接雙特異性單鏈抗體VHA-肽-VLA-連接肽-VLB-肽-VHB應(yīng)用亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)蓡捂溈贵w連接起來。VHA-肽-VLA-Leu拉鏈（鉸鏈區(qū)）-VLB-肽-VHB4.制備BisFvs的方法核心是將兩條SCFV以一定方式連接起來，并使其各自保留與特異性抗原結(jié)合的能力。亮氨酸拉鏈實(shí)質(zhì)上是一段長約35個(gè)氨基酸的寡肽，其中每7個(gè)氨基酸出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸殘基，共有5個(gè)亮氨酸殘基。利用亮氨酸拉鏈介導(dǎo)SCFV或Fab片段在細(xì)胞內(nèi)二聚化連接2種分子可以制備基因工程同質(zhì)雙價(jià)或異質(zhì)雙特異性Bs(sFv)2和(Fab)2小抗體。亮氨酸拉鏈作為一種具有特殊作用的短肽，是雙特異性抗體制備最簡單的模型系統(tǒng)

將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。將雙鏈抗體的一條臂針對抗原，另一臂針對免疫球蛋白，這種雙鏈抗體可與免疫球蛋白結(jié)合，恢復(fù)抗體的全部功能，包括結(jié)合補(bǔ)體、誘導(dǎo)單核細(xì)胞內(nèi)的呼吸爆發(fā)和吞噬功能、增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷細(xì)胞的協(xié)同作用等。

5.在治療中的應(yīng)用

利用其能與2個(gè)抗原結(jié)合的能力，設(shè)計(jì)出更高效的免疫阻斷抗體、免疫組化抗體等。Kontermannn等設(shè)計(jì)的雙特異抗體，一條臂可與抗原蛋清溶菌酶(HEL)、癌胚抗原(CEA)、HIV一1GP120結(jié)合，另一條臂為抗大腸桿菌半乳糖苷酶。以該雙鏈抗體作為酶結(jié)合物，用ELISA法檢測HEL，免疫組化法檢測CEA，免疫印跡法檢測GP120，加人特異抗體后，再加人B半乳糖苷酶，洗滌后加人底物顯色，結(jié)果表明，這些方法可檢出相應(yīng)的抗原，證明雙特異抗體可用于酶免疫分析。6.在免疫診斷中的應(yīng)用Atwell等制備的雙特異抗體，一條臂抗紅細(xì)胞表面血型糖蛋白的，另一條臂抗神經(jīng)氨酸酶，中間用一段5個(gè)氨基酸(Gly4Set)的接頭連接。這段接頭的作用是阻止VH、VL結(jié)合于一個(gè)分子，并穩(wěn)定二聚體的形態(tài)。該抗體可與上述抗原結(jié)合，以此建立快速的全血凝集試驗(yàn)。

多功能抗體--單鏈抗體多聚體（SCFV多聚體）

在SCFV的基礎(chǔ)上發(fā)展了結(jié)合性能良好的SCFV多聚體，包括二聚體、三聚體和四聚體等，這些多價(jià)、多效能、高親和力的新型小分子抗體較單鏈抗體具有諸多優(yōu)勢。其顯著優(yōu)點(diǎn)是它的高親和力性能，由于具有多個(gè)結(jié)合價(jià)，可同時(shí)與細(xì)胞膜上相鄰的兩個(gè)或多個(gè)靶抗原結(jié)合，與腫瘤細(xì)胞表面抗原的多價(jià)結(jié)合有利于腫瘤的影象分析及治療。有應(yīng)用價(jià)值的SCFV多聚體應(yīng)具有以下特征：1）能高選擇、高親和性地同靶抗原或腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合2）在血液循環(huán)中，與效應(yīng)細(xì)胞或細(xì)胞毒觸發(fā)分子有較低親和力3）應(yīng)為人源化抗體，最大限度地減少人抗鼠蛋白的排斥反應(yīng)，使重復(fù)給藥不受限制4）分子應(yīng)大小適中，既能滲透到腫瘤組織內(nèi)部，又能保持適當(dāng)?shù)臏魰r(shí)間抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,稱之為抗體融合蛋白?？贵w融合蛋白

①配基-配基型融合蛋白②配基-Ig型嵌合蛋白1.常見類型③配基-FV嵌合蛋白

④受體–FV型融合蛋白

⑤酶-抗體型融合蛋白（抗體酶）2.構(gòu)建抗體融合蛋白的原則將前一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共表達(dá)。在抗體的N端和C端融合其它蛋白都可以獲得成功。關(guān)鍵是兩個(gè)蛋白間的接頭序列l(wèi)inker，一般說來3~5個(gè)氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。基因工程抗體與IL-2的融合蛋白在腫瘤治療中可特異性將IL-2的作用集中在腫瘤局部，以減少對周身的副作用?？贵w融合蛋白能特異定位于腫瘤局部，輸送高濃度的IL-2，從而充分發(fā)揮細(xì)胞因子激活的效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。酶-抗體型融合蛋白-抗體酶或催化性抗體（AbzymeorCatalyticantibody）抗體酶的制備方法1）使用與過度態(tài)結(jié)構(gòu)相似的半抗原通過雜交瘤方法生產(chǎn)；2）對抗體分子進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體分子與催化基因相連；3）通過過度態(tài)類似分子對抗體庫進(jìn)行篩選獲得符合要求的抗體酶?？贵w酶在藥學(xué)方面的應(yīng)用主要表現(xiàn)在：1）抗體酶前體藥物療法，即利用抗體酶將靶部位的前體轉(zhuǎn)化成有效的藥物，這樣可以提高該處的藥物濃度，避免藥物對正常組織的傷害；2）在藥物合成中實(shí)現(xiàn)普通有機(jī)化學(xué)反應(yīng)以及催化反應(yīng)難以實(shí)現(xiàn)的藥物合成反應(yīng)，尤其在抗生素和天然藥物的合成方面應(yīng)用較多；3）抗體酶還可以用于選擇性地水解病毒蛋白的肽鍵，從而阻止病毒與靶細(xì)胞結(jié)合，或是選擇性地水解癌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從而有效地破壞癌細(xì)胞膜，達(dá)到治療癌癥的目的。（1）其中較為成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗體型融合蛋白（即抗體酶，abeneyme）在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療（ADEPT）。（2）抗體酶在藥物治療中的應(yīng)用前景被醫(yī)學(xué)界普遍看好，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療。3.抗體融合蛋白的應(yīng)用

前體藥物：該藥物需在體內(nèi)經(jīng)特定酶催化后才顯示活性的藥物。

當(dāng)抗體和酶的融合蛋白定位在腫瘤部位后再給予前體藥物，其優(yōu)點(diǎn)是提高腫瘤區(qū)域的藥物濃度，降低對正常細(xì)胞的毒性。該方法可使藥物濃度在腫瘤部位提高10倍，而在正常組織中降低2—3倍。免疫融合蛋白基因表達(dá)可用真核細(xì)胞，也可用原核細(xì)胞表達(dá)（分泌/包含體表達(dá)）?；蚬こ炭贵w與IL-2的融合蛋白能特異定位于腫瘤局部，減少對周身的不良反應(yīng)。CTLA4-Ig的應(yīng)用：T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號，只接受第一個(gè)信號時(shí)，并不產(chǎn)生活化，而是進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)，甚至導(dǎo)致程序性死亡，許多分子參與第二信號的傳遞，其中B7和CD28/CTLA4被認(rèn)為是最重要的共刺激分子。CTLA4（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4）位于T細(xì)胞表面，為B7受體，與B7的親和力是CD28的20倍。CD28與CTLA4的功能有著明顯的差別：在有第一信號存在的情況下，B7與CD28結(jié)合后，共刺激信號傳遞給T細(xì)胞，產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答；而B7與CTLA4結(jié)合后，則對T細(xì)胞的免疫應(yīng)答起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CTLA4-Ig是由人CTLA4分子的胞外區(qū)，與人的IgG1的恒定區(qū)CH2和CH3區(qū)融合而成的可溶性嵌合蛋白，可與人/大鼠/小鼠的B7分子結(jié)合。CTLA4-Ig是一種高效/無毒并兼有免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受的生物免疫抑制劑，對移植排斥的防治和一些自身免疫疾病的治療具有廣闊的應(yīng)用前景。第五節(jié)抗體工程

抗體研究的沿革①多克隆抗體

1890年~1975年，是用抗原免疫動(dòng)物，獲得多克隆抗體②單克隆抗體

1975年~20C90Y，以雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體③以基因工程方法制備抗體基因工程技術(shù)制備；以1994年Winter創(chuàng)建噬菌體抗體庫技術(shù)為代表基因工程抗體不用人工免疫動(dòng)物和雜交瘤技術(shù)，完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，而且還利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)，通過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程一、噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法

1.獲取目的基因

提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段（如VH和VL），抗體基因的組合形式多為單鏈抗體，2.抗體庫技術(shù)的載體

目前應(yīng)用最多的是噬菌粒（質(zhì)粒-噬菌體），它具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點(diǎn)；轉(zhuǎn)化效率高，抗體基因文庫容量大

3.淘篩

抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復(fù)與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴(kuò)增4.表達(dá)與鑒定

目的克隆經(jīng)過鑒定后，導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)物用westernblot分析確定后，就完成了全過程

二、噬菌體抗體庫的分類（一）按抗體基因的性質(zhì)分1.DNA文庫2.cDNA文庫（二）按抗體基因的來源分1．天然抗體庫(nativeantibodylibrary)2．免疫抗體庫3．半合成抗體庫4．全合成抗體庫三、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)

1.模擬天然全套抗體庫

抗體文庫可以達(dá)到1011庫容，可包含B細(xì)胞的全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA，抗體的VH和VL基因進(jìn)行隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。因此，能模擬天然全套抗體庫2.避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，可以“挑出”任意的抗體基因，因而免除了人工免疫和細(xì)胞融合3.可獲得高親和力的人源化抗體

在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親合力成熟的過程，所用的抗體基因又都來自人體，因此所產(chǎn)生的抗體必然都是高親合力的人源化抗體四、基因工程抗體的表達(dá)

1.原核生物融合表達(dá)和分泌表達(dá)

2.真核生物如酵母、昆蟲細(xì)胞、中國倉鼠卵細(xì)胞等，都是分泌表達(dá)

3.轉(zhuǎn)基因植物煙草葉中的表達(dá)（植物抗體）

4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物單基因水平，還處于研發(fā)階段五、噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，六、基因工程抗體的表達(dá)1、原核細(xì)胞表達(dá)：融合表達(dá)，分泌表達(dá)。2、真核細(xì)胞表達(dá)：酵母，昆蟲細(xì)胞，CHO，真菌等3、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)：煙草，擬南芥4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)：轉(zhuǎn)基因鼠可不經(jīng)過免疫，利用抗原從庫中直接篩選出特異性抗體，獲得抗體的時(shí)間短，可大量生產(chǎn)，特別是能直接獲得人源化抗體。用SCID小鼠制備人單抗SCID小鼠移植入人淋巴細(xì)胞（人鼠嵌合模型）抗原免疫雜交瘤技術(shù)基因工程人單抗人抗體鼠—將小鼠Ig基因滅活，然后轉(zhuǎn)入人Ig基因，生產(chǎn)出人單抗遺傳工程鼠基因工程抗體真核細(xì)胞高效表達(dá)流程圖第六節(jié)抗體診斷試劑

抗原和抗體的特異性結(jié)合在體內(nèi)和體外都可呈現(xiàn)某種反應(yīng)。在體內(nèi)可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，可作為藥物用于治療；在體外可發(fā)生凝集或沉淀等反應(yīng)，可用已知抗體來鑒定抗原，作病原學(xué)的診斷和血型測定，成為血清學(xué)鑒定。主要有三大類抗體診斷用藥（習(xí)慣上將體外試驗(yàn)用的稱為試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診斷用的稱為藥物）

概況免疫學(xué)的迅速發(fā)展使診斷技術(shù)不斷更新，抗體用于診斷，體現(xiàn)在三類診斷藥物中：①血清學(xué)診斷中使用的抗體制劑(體外診斷)②免疫標(biāo)記用的抗體制劑(體外診斷)③體內(nèi)導(dǎo)向診斷的抗體藥物(體內(nèi)診斷)一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑

血清學(xué)鑒定是指用已知抗體來鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的診斷和血型鑒定。常用凝集反應(yīng)

此類診斷血清是臨床病原菌診斷的有力工具，是診斷試劑中重要的一類試劑。若用單克隆抗體還可以檢測出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異，鑒定細(xì)菌的種型和亞種，這是傳統(tǒng)血清法或動(dòng)物免疫法所做不到的，而且診斷異常準(zhǔn)確

（1）常用診斷血清的品種和用途（表4-6）

如：血液分型血清——血型檢測沙門氏菌診斷血清——腸道病原菌（如傷寒、副傷寒桿菌）志賀氏菌診斷血清——細(xì)菌性痢疾病原菌大腸桿菌診斷血清——大腸桿菌（2）診斷血清的制備制備細(xì)菌抗原免疫動(dòng)物制備抗體血清（3）診斷血清診斷方法直接凝集反應(yīng)：向細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原中加入相應(yīng)抗體后，在有適量電解質(zhì)存在下，能形成肉眼可見的凝塊（常用玻片法做定性試驗(yàn)）

1.鑒定病原菌的抗體試劑2.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動(dòng)血凝診斷試劑

（1）檢測方法：早期檢測HBsAg曾用雙向瓊脂擴(kuò)散法和對流電泳法；但由于敏感度不高而被衛(wèi)生部禁用?，F(xiàn)在運(yùn)用反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)（RPHA）進(jìn)行檢測（2）檢測原理：紅細(xì)胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)純化的抗乙肝病毒血清吸附其上時(shí)便具有抗體活性，若待測樣品中有乙型肝炎病毒表面抗原時(shí)，則發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)而使血細(xì)胞發(fā)生凝集（3）方法特點(diǎn)：用純化的抗體致敏醛化血細(xì)胞測定相應(yīng)抗原，其靈敏度高、操作簡單、快速、價(jià)廉、不需特殊設(shè)備，已被廣泛用于乙肝病例檢測（4）制劑方法：先用HBsAg免疫豚鼠，獲得抗-HBsAg血清，經(jīng)（NH4）2S04鹽析及DEAE-Sephadex柱層析，取其IgG,再將新鮮O型紅細(xì)胞用丙酮和甲醛處理，然后用純化的抗-HBsAg血清于pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細(xì)胞，洗去多余的蛋白質(zhì)成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成3.妊娠診斷試劑

妊娠后，血液和尿液中的絨毛膜促性腺激素（HCG）含量增高，在三個(gè)月內(nèi)達(dá)到高峰。測定方法有生物試驗(yàn)法、膠乳間接凝集試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、放射免疫測定法

膠乳間接凝集法：膠乳中加入HCG致敏（試劑為膠乳和抗-HCG血清）

膠乳直接凝集法：膠乳中加入HCG抗體致敏（試劑只用膠乳）血型有多個(gè)系統(tǒng)，其中最重要的是ABO血型系統(tǒng)，按人紅細(xì)胞表面帶有的A或B種凝集原來分型。4.抗ABO血型系統(tǒng)血清ABO血型抗血清的制備①人源性ABO血型抗血清是采集健康獻(xiàn)血人的血液，凝固后，置4℃過夜，使非特異性抗體吸附在血塊上一起除掉；然后分離血清，加入疊氮鈉防腐，56℃30min滅能，使補(bǔ)體等活性喪失；在抗A血清中加入美藍(lán)，在抗B血清中加入復(fù)紅，以資區(qū)別，分裝保存②動(dòng)物源性ABO血型抗血清是用人血型物質(zhì)A和B免疫馬得到的抗體血清，然后用O型紅細(xì)胞吸附去掉非特異性抗體，再加防腐劑，除菌過濾，分裝③單克隆抗體是應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗A或抗B血清（但由于單克隆抗體特異性極高，而血型物質(zhì)較復(fù)雜，易得到假陰性結(jié)果）二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑

對于常規(guī)方法不能觀察的Ag-Ab反應(yīng)，可用放射性核素、熒光素或酶對抗體標(biāo)記的方法，將Ag-Ab反應(yīng)放大，提高反應(yīng)的敏感性，可對微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測。（一）熒光抗體診斷試劑

用熒光色素標(biāo)記抗體，當(dāng)抗原與抗體反應(yīng)時(shí)可發(fā)出熒光。可用于定性或定量（二）放射免疫用抗體診斷試劑

用放射性核素（如125I）標(biāo)記抗體，制備成抗體診斷試劑。此法具有放射性核素分析的高度靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)

（一）熒光抗體診斷試劑免疫熒光技術(shù)：用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、羅丹明(Rhodamine)或藻紅素等熒光色素標(biāo)記抗體，直接向組織切片或細(xì)胞懸液滴染，在熒光顯微鏡下或用流式分光光度計(jì)（流式細(xì)胞儀）觀察。熒光抗體的制備

免疫熒光測定方法（1）直接法：采用熒光抗體直接與抗原反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：特異性高；缺點(diǎn)：每種抗原須單獨(dú)制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）簡接法：用熒光標(biāo)記抗球蛋白抗體（熒光第二抗體）來檢測未知抗原。只需制備一種熒光標(biāo)記的抗體，即可用以檢測多種抗原抗體系統(tǒng)，敏感度比直接法高5～10倍。免疫熒光（神經(jīng)元）免疫熒光顯像系統(tǒng)（二）免疫酶抗體診斷試劑用酶標(biāo)記來檢測抗原，分為免疫酶染色（組比法）和酶免疫測定兩種類型。免疫酶染色法用酶標(biāo)記抗體，稱為酶標(biāo)抗體。測定時(shí)酶標(biāo)抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)生組化反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，可在光學(xué)顯微鏡下直接觀察。常用辣根過氧化物酶(horseradishpeiroxidase，HRP)標(biāo)記抗體，加入酶底物－二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)。如果抗體與抗原結(jié)合，底物將被分解，呈現(xiàn)棕褐色。酶免疫測定（ELA）是一種在液相內(nèi)微量待檢抗原物質(zhì)的定量測定方法。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)：ELISA

酶免疫測定在方法上的一個(gè)重大改進(jìn)，使抗原或抗體吸附在聚苯乙烯塑料等表面上進(jìn)行反應(yīng)，大大簡化了抗原抗體結(jié)合物的分離過程。用途廣泛，敏感度高，既可定性也可定量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)――ELISA酶聯(lián)免疫反應(yīng)示意酶標(biāo)儀間接法：用于檢測血清中抗體載體抗原＋抗體（待檢血清）＋酶標(biāo)抗抗體＋底物-→顯色反應(yīng)夾心法：檢測標(biāo)本中抗原載體抗體＋抗原（待檢標(biāo)本）＋酶標(biāo)抗體（特異性）＋底物-→顯色反應(yīng)ELASA（競爭法）生物素-抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物可作為一種指示劑，組成一個(gè)新的生物放大系統(tǒng)。該法特異性強(qiáng)、結(jié)合穩(wěn)定，在與抗體、酶、熒光素等結(jié)合后不影響后者的生物活性，可用于檢測多種抗原抗體系統(tǒng)。靈敏度：擴(kuò)散試驗(yàn)<電泳試驗(yàn)<凝集試驗(yàn)<ELISA<BAS-ELISA、放射免疫分析試驗(yàn)。生物素-酶標(biāo)抗生素蛋白系統(tǒng)抗體診斷試劑（BAS-ELISA）（三）放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術(shù)：靈敏度最高的檢測手段。診斷試劑設(shè)計(jì)中考慮的是用放射性同位素131I和125I標(biāo)記抗體，放射自顯影檢測。把同位素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)結(jié)合起來。在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中可用放射性自顯影法檢測微量抗原物質(zhì)。放射免疫（競爭法）結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原（B）與游離態(tài)的標(biāo)記抗原（F）三、導(dǎo)向診斷藥物在體內(nèi)直接診斷病原的抗體試劑被稱為導(dǎo)向診斷藥物。放射免疫顯像定位技術(shù)是把特異性與病原細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體預(yù)先同重金屬絡(luò)合劑—二乙基三胺五乙酸(DTPA)耦聯(lián)成Ab-DTPA，注入體內(nèi)，“自動(dòng)尋的”與病原細(xì)胞結(jié)合；再注入In-113M（放射性核素，銦），使其與DTPA絡(luò)合。放射免疫顯像定位技術(shù)通過放射自顯影，可以對病原細(xì)胞(如腫瘤)進(jìn)行組織定位、顯示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移形成的病灶、觀察抗體在血液中的功能半衰期、確定肌體對抗體做出的不良反應(yīng)等。導(dǎo)向診斷藥物的顯像腫瘤標(biāo)記物放射免疫顯像

白細(xì)胞分化抗原是不同譜系白細(xì)胞分化、成熟的不同階段表達(dá)的細(xì)胞表面抗原分子，亦即白細(xì)胞表面標(biāo)記。它們參與機(jī)體重要的生理和病理過程。例如：（1）免疫應(yīng)答過程中免疫細(xì)胞的相互識別，免疫細(xì)胞抗原識別、活化、增殖和分化，免疫效應(yīng)功能的發(fā)揮；（2）造血細(xì)胞的分化和造血過程的調(diào)控；（3）炎癥發(fā)生；（4）細(xì)胞的遷移如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。

四、CD單克隆抗體系列

應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的聚類分析法，將識別同一分化抗原的來自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體歸為一個(gè)分化群，簡稱CD（clusterofdifferentiation)，按照發(fā)現(xiàn)的順序，白細(xì)胞分化抗原的命名從CD1、CD3，已達(dá)到CD247。用異硫氰酸熒光黃或羅丹明標(biāo)記這些分子，在免疫學(xué)上認(rèn)識淋巴T細(xì)胞的功能、分化、信息傳遞等具有十分重要的意義。四、CD單克隆抗體系列CD4細(xì)胞第七節(jié)抗體治療藥物

以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物的研究已有近20年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤相關(guān)的抗原，但治療用的制劑還沒有一種達(dá)到商品化的程度主要障礙：

①抗體相對分子量大，穿透力低，不能達(dá)到靶部位或靶位攝取量低②鼠源性McAb的排異反應(yīng)抗體藥物研究概況一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物

抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，應(yīng)用比較成功優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、用量小，且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)，放射性標(biāo)記的抗體有較大的殺傷范圍，有利于克服腫瘤表面抗原的異質(zhì)性，對腫瘤細(xì)胞的殺傷也不依賴抗原抗體結(jié)合后的吸收作用，